質(zhì)粒的提取及鑒定

1、質(zhì)粒的提取及鑒定實驗六實驗六質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的少量提取及鑒定的少量提取及鑒定生物化學(xué)與分子生物學(xué)系質(zhì)粒的提取及鑒定目的要求目的要求 了解質(zhì)粒的概念。了解質(zhì)粒的概念。 熟悉提取質(zhì)粒的基本原理。熟悉提取質(zhì)粒的基本原理。 掌握堿變性法提取質(zhì)粒掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。的方法。質(zhì)粒的提取及鑒定a.a.什么是質(zhì)粒（什么是質(zhì)粒（plasmidplasmid）？）？b.b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.c.質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？c.c.質(zhì)粒有哪些特點？質(zhì)粒有哪些特點？d.d.質(zhì)粒的用途有哪些？質(zhì)粒的用途有哪些？31.1.關(guān)于質(zhì)粒的概念關(guān)于質(zhì)粒的概念質(zhì)粒的提取及鑒定質(zhì)粒的定義質(zhì)粒的定

2、義 質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復(fù)制的質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNADNA分分子子，能穩(wěn)定地，能穩(wěn)定地獨立于染色體外獨立于染色體外，并傳遞到子代，一般不整，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。合到宿主染色體上。 在細胞內(nèi)它們常以在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。形式存在。 4質(zhì)粒的提取及鑒定超螺旋超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA) 線狀線狀DNA (linear DNA, L DNA): 如果兩條鏈均斷開，即為線狀如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNA。（3）開環(huán)）開環(huán)DNA (open circular DNA, OC D

3、NA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。環(huán)狀分子。質(zhì)粒的三種構(gòu)型質(zhì)粒的三種構(gòu)型5質(zhì)粒的提取及鑒定質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的一般特性：的一般特性：(1)宿主菌染色體宿主菌染色體DNA通常比質(zhì)粒通常比質(zhì)粒DNA要大得多要大得多(2)它是它是雙鏈閉合環(huán)狀雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等。，分子量大小不等。(3)質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子,有有相對獨立性相對獨立性。(4)它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞一些它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主

4、細胞一些表型表型：菌毛、抗藥性等菌毛、抗藥性等 質(zhì)粒的提取及鑒定分離純化質(zhì)粒分離純化質(zhì)粒DNADNA的主要步驟的主要步驟(1)(1)培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增（培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增（DNADNA的擴增與選擇）的擴增與選擇）(2)(2)細菌的收集與裂解細菌的收集與裂解 v收集方法：高速離心的方法 (3)(3)質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的純化的純化 v 2 2 提取大腸桿菌質(zhì)粒提取大腸桿菌質(zhì)粒DNADNA的方法和原則的方法和原則質(zhì)粒的提取及鑒定原理示意圖原理示意圖質(zhì)粒的提取及鑒定實驗原理：實驗原理：高堿高堿細菌的細胞壁破裂，內(nèi)容物釋放細菌的細胞壁破裂，內(nèi)容物釋放染色體染色體DNA斷裂成不同長度的線性雙鏈斷裂成不同

5、長度的線性雙鏈DNA；線性雙鏈線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。質(zhì)粒質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；雙鏈雙鏈DNA并不完全分離。并不完全分離。高酸高酸中和中和至中至中性性變性的染色體變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚與變性的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化純化RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用除去殘留的蛋白質(zhì)，并用除去殘留的蛋白質(zhì)質(zhì)粒的提取及鑒定試劑盒主要試劑及作用試劑盒主要試

6、劑及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTAEDTA、TrisTrisHClCl組成組成. .( (保護、緩沖保護、緩沖) ) 葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的減少抽提過程中的 機械機械 剪切作用剪切作用,防止破壞質(zhì)粒防止破壞質(zhì)粒. (保護作用保護作用) EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子, 防止防止DNA酶對酶對質(zhì)粒分子的降解作用。（保護作用）質(zhì)粒分子的降解作用。（保護作用） TrisHCl 能使溶菌液維持溶菌作用的最適能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作范圍（緩沖作用）用）10質(zhì)粒的提取及鑒定 溶液溶

7、液IIII：由由SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）與十二烷基硫酸鈉）與 NaOH NaOH 組成組成( (裂解、變性裂解、變性) ) SDSSDS是離子型表面活性劑是離子型表面活性劑,其主要作用是：溶解細胞膜上的脂其主要作用是：溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，從而破壞細胞膜；解聚細胞中的核蛋白；使蛋白質(zhì)與蛋白，從而破壞細胞膜；解聚細胞中的核蛋白；使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。質(zhì)變性而沉淀下來。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下來的提取過程必須把它去除干凈，以便后續(xù)更好地進在接下來的提取過程必須把它去除干凈，以便后續(xù)更好地進行。行。 NaOHNaOH（PH12PH12）的作用是

8、破壞氫鍵，使）的作用是破壞氫鍵，使DNADNA分子變性（分子變性（DNADNA變變性作用）性作用）可瞬間溶解細胞及細菌?？伤查g溶解細胞及細菌。11試劑盒主要試劑及作用試劑盒主要試劑及作用質(zhì)粒的提取及鑒定溶液溶液IIIIII：pH4.8 KAC(KAC(乙酸鉀乙酸鉀) ) 高鹽溶液，高鹽溶液，pHpH調(diào)至中性調(diào)至中性 ( (復(fù)性，分離復(fù)性，分離) )中和溶液中和溶液的堿性，使染色體的堿性，使染色體DNA DNA 變性而發(fā)生纏繞，并變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒使質(zhì)粒DNADNA復(fù)性。復(fù)性。KACKAC會與會與SDSSDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成 沉淀而除去；

9、溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也會與蛋白質(zhì)也會與蛋白質(zhì)-SDS-SDS 復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNADNA分離。分離。試劑盒主要試劑及作用試劑盒主要試劑及作用質(zhì)粒的提取及鑒定吸附株純化質(zhì)粒吸附株純化質(zhì)粒DNADNA質(zhì)粒的提取及鑒定實驗步驟實驗步驟1.1.收集收集4.5ml4.5ml菌液于菌液于EPEP管，每次管，每次12000g12000g30s30s 2.2.棄上清，加含棄上清，加含Rnase ARnase A溶液溶液I I 250 250 l l ，劇烈振蕩劇烈振蕩3.3.加加250250l l 溶液溶液IIII，快速顛倒數(shù)次，快速顛倒數(shù)

10、次 4.4.加加350350l l 溶液溶液IIIIII，溫和振蕩，溫和振蕩10s10s，12000g12000g10min10min5.5.轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移500500l l上清到吸附株，上清到吸附株，12000g12000g1min1min 6.6.吸附柱中加吸附柱中加700l700l漂洗液，漂洗液，1200012000g g1min1min，棄廢液，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。將吸附柱放入收集管中。7.7.向吸附柱中加入向吸附柱中加入500l500l漂洗液，漂洗液，1200012000g g1min1min，棄廢，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。液，將吸附柱放入收集管中。 12000g 1200

11、0g2min2min，8.8.將吸附柱敞口置于室溫放置將吸附柱敞口置于室溫放置2min2min，揮發(fā)殘余的乙醇。，揮發(fā)殘余的乙醇。9.9.將吸附柱放入一個將吸附柱放入一個干凈的干凈的EPEP管管中，向吸附膜中，向吸附膜中央懸空中央懸空滴加滴加50l50l經(jīng)經(jīng)6565水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min2min，1200012000g g1min1min。10.10.將此質(zhì)粒將此質(zhì)粒DNADNA溶液置于溶液置于-20-20保存。保存。質(zhì)粒的提取及鑒定153、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定的瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒的提取及鑒定實驗材料及試劑實驗材料及試劑質(zhì)粒的提取及鑒定

12、質(zhì)粒的提取及鑒定影響影響DNADNA在凝膠中遷移速率的因素在凝膠中遷移速率的因素 v1 DNA分子的大小v2 構(gòu)象v3 凝膠濃度v4 電壓v5 緩沖液質(zhì)粒的提取及鑒定OC 型質(zhì)粒型質(zhì)粒DNA點樣孔點樣孔細菌基因組細菌基因組DNAL型質(zhì)粒型質(zhì)粒DNASC 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA細菌細菌RNA質(zhì)粒電泳圖譜質(zhì)粒電泳圖譜質(zhì)粒的提取及鑒定實驗步驟實驗步驟 瓊脂糖凝膠板的制備瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備（封板、制備1%凝膠待溫度降至凝膠待溫度降至60-70時加入時加入EB（0.5/ml） 、倒膠、插梳、凝固后拔梳）、倒膠、插梳、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣倒緩沖液，加樣（取質(zhì)粒取質(zhì)粒DNA樣品液樣品液 5l +

13、1l上樣緩沖液，混勻上樣緩沖液，混勻 ）電泳（電泳（100V 20min左右，左右，5V/cm）紫外燈下檢測紫外燈下檢測質(zhì)粒的提取及鑒定移液器的使用移液器的使用將微量液體從一個容器轉(zhuǎn)移到另一個容器的計量器具，將微量液體從一個容器轉(zhuǎn)移到另一個容器的計量器具，我們稱之為移液器。我們稱之為移液器。質(zhì)粒的提取及鑒定移液器的使用移液器的使用移液循環(huán)移液循環(huán)安裝槍頭安裝槍頭設(shè)定容量設(shè)定容量吸液吸液放液放液卸去槍頭卸去槍頭質(zhì)粒的提取及鑒定移液器的使用移液器的使用安裝槍頭安裝槍頭質(zhì)粒的提取及鑒定移液器的使用移液器的使用原點第一停點第二停點勿在液體中按至第一停點槍頭勿伸入液面太深管壁加入排盡液體復(fù)位后，卸去槍頭

14、質(zhì)粒的提取及鑒定移液器的使用移液器的使用卸去槍頭卸去槍頭無需用手接觸槍頭無需用手接觸槍頭質(zhì)粒的提取及鑒定 1、加樣槍正確使用；、加樣槍正確使用； 2、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型；、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要換槍頭；、加不同溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干；、離心前把管擦干； 6、轉(zhuǎn)移上清時不要吸到沉淀；、轉(zhuǎn)移上清時不要吸到沉淀； 7、使用前請先檢查溶液使用前請先檢查溶液和溶液和溶液是否出現(xiàn)混濁；是否出現(xiàn)混濁； 8、溶液溶液、溶液、溶液和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。 9、洗

15、脫液不少于、洗脫液不少于 50l，-20保存，以防保存，以防 DNA 降解。降解。質(zhì)粒提取注意事項：質(zhì)粒提取注意事項：質(zhì)粒的提取及鑒定1.凝膠濃度選擇根據(jù)樣品凝膠濃度選擇根據(jù)樣品DNA分子大小而定，所分子大小而定，所 以電泳前應(yīng)對以電泳前應(yīng)對DNA片段大小有粗略估計。片段大小有粗略估計。2.加加EB時，膠的溫度不要太高。高溫會導(dǎo)致時，膠的溫度不要太高。高溫會導(dǎo)致EB揮揮 發(fā)，發(fā)，EB有致癌性。倒膠時避免產(chǎn)生氣泡。有致癌性。倒膠時避免產(chǎn)生氣泡。3.緩沖液要完全沒過點樣孔。點樣孔不能有氣泡。緩沖液要完全沒過點樣孔。點樣孔不能有氣泡。4.紫外線照射不要太久。尤其避免直接照射皮膚。紫外線照射不要太久。

16、尤其避免直接照射皮膚。瓊脂糖電泳注意事項：瓊脂糖電泳注意事項：質(zhì)粒的提取及鑒定質(zhì)粒的定義質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復(fù)制的質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNADNA分分子子，能穩(wěn)定地，能穩(wěn)定地獨立于染色體外獨立于染色體外，并傳遞到子代，一般不整，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。合到宿主染色體上。 在細胞內(nèi)它們常以在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。形式存在。 28質(zhì)粒的提取及鑒定質(zhì)粒的提取及鑒定質(zhì)粒的提取及鑒定基因克隆示意圖基因克隆示意圖 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿主細胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細胞陽性克隆株繁殖表達分、切分、切接接

17、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)篩篩實現(xiàn)基因克隆所實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為關(guān)的工作統(tǒng)稱為重組重組DNA技術(shù)，技術(shù)，又稱基因工程。又稱基因工程。質(zhì)粒的提取及鑒定2 BamHI 2 BamHI 、HindHind酶切質(zhì)粒及鑒定酶切質(zhì)粒及鑒定2.1 2.1 實驗原理：實驗原理： 利用限制性內(nèi)切酶特異的識別利用限制性內(nèi)切酶特異的識別DNADNA特異的特異的核苷酸序列，并切割核苷酸序列，并切割DNA,DNA,產(chǎn)生一定長度的產(chǎn)生一定長度的DNADNA片段，通過電泳對酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒片段，通過電泳對酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因（重組質(zhì)粒別目的基因（重組質(zhì)粒DNADNA）32質(zhì)粒的提取及鑒定實驗

18、七實驗七質(zhì)粒質(zhì)粒DNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的的濃度測定與雙酶切鑒濃度測定與雙酶切鑒定定天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系辛靈彪質(zhì)粒的提取及鑒定1.熟悉熟悉DNA的濃度測定方法。的濃度測定方法。2.了解限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程中的應(yīng)用。了解限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程中的應(yīng)用。3.熟悉利用限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的方法。熟悉利用限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的方法。目的要求目的要求質(zhì)粒的提取及鑒定實驗原理實驗原理1.1.質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA濃度測定濃度測定質(zhì)粒的提取及鑒定1. DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相當(dāng)于相當(dāng)于50 g/ml雙鏈雙鏈DNA40g/ml單鏈單鏈DNA（或（或R

19、NA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度DNA純品純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品純品: OD260/OD280 = 2.0OD260的應(yīng)用的應(yīng)用質(zhì)粒的提取及鑒定DNA樣品的濃度（g/l）= OD260稀釋倍數(shù)50/1000OD260/OD280=1.7-1.9打開紫外分光光度計，設(shè)定波長260nm,切換至紫外。1.1.質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA濃度測定方法濃度測定方法200倍稀釋樣品，10l質(zhì)粒加水稀釋至2000l洗凈比色皿，加入待測樣品。記錄260nm的OD值。設(shè)定波長280nm，記錄OD值。計算樣品濃度和純度質(zhì)粒的提取及鑒定限制性核酸內(nèi)切酶

20、限制性核酸內(nèi)切酶定義：定義：能在特異位點（酶切位點）上催化雙鏈能在特異位點（酶切位點）上催化雙鏈DNADNA分分子的斷裂子的斷裂, ,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNADNA片段。片段。 切割不同來源的切割不同來源的DNADNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價值（切圖譜，具有重大應(yīng)用價值（“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”）。）。 主要存在于細菌體內(nèi)。主要存在于細菌體內(nèi)。382.2.質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA雙酶切鑒定雙酶切鑒定質(zhì)粒的提取及鑒定第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第

21、二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 限制性核酸內(nèi)切酶命名限制性核酸內(nèi)切酶命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶質(zhì)粒的提取及鑒定 限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式質(zhì)粒的提取及鑒定（1）20l酶切體系：取兩支1.5ml的Ep管，標(biāo)號，按下表加入試劑，實驗組實驗組對照組對照組1010酶解反應(yīng)液酶解反應(yīng)液2 2l2 2l質(zhì)粒質(zhì)粒DNAup to 1up to 1gup to 1up to 1gXhoIXhoI1 1l0 0lHindHind1 1l0 0lddHddH2 2O O至至20l至至20l（2）