ISSR分子標(biāo)記及其在果樹遺傳學(xué)的應(yīng)用

1、 福建農(nóng)林大學(xué)研究生課程考試卷授課時間 2012 2013 學(xué)年度 第 一 學(xué)期學(xué)號：_研究生姓名： _ 課程名稱：_ _果樹遺傳學(xué) _考試時間： _ 2012.12.25_ _考生成績：_授課或主考教師：_（簽章）ISSR分子標(biāo)記及其在果樹遺傳學(xué)的應(yīng)用摘要：ISSR分子標(biāo)記是在SSR分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種DNA多態(tài)性檢測技術(shù)。它是DNA分子標(biāo)記技術(shù)的一種，已在果樹遺傳育種研究的各個方面得到廣泛的應(yīng)用。ISSR標(biāo)記符合孟德爾式遺傳規(guī)律，具有簡便、快速、穩(wěn)定、DNA 多態(tài)性高等優(yōu)點。本文主要介紹了ISSR分子標(biāo)記在果樹遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等研究的應(yīng)用。

2、關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記；ISSR；果樹；遺傳 20世紀(jì)90年代以來，由于PCR技術(shù)的出現(xiàn)，基于PCR技術(shù)的DNA分子標(biāo)記，如隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)或稱微衛(wèi)星(microsatellite)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)等受到廣泛重視和應(yīng)用1。但RAPD重復(fù)性低,AFLP費用昂貴, SSR引物設(shè)計費時耗力,使得它們的應(yīng)用受到一定程度的限制。 近幾年，人們基于SSR分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)

3、展了一種新的分子標(biāo)記，即錨定簡單重復(fù)序列（anchored simple sequence repeat，ASSR），也稱作簡單重復(fù)間序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)標(biāo)記技術(shù)或以微衛(wèi)星為引物的PCR(microsatellite primed PCR,MP-PCR)2。它是由加拿大蒙特里爾大學(xué)的Zietkiewicz等1994年提出的3。該技術(shù)以加錨SSR寡聚核苷酸作引物，對位于反向排列的SSR之間的DNA序列進行PCR擴增，而不是擴增SSR本身，它在引物設(shè)計上比SSR技術(shù)簡單得多，不需知道DNA序列即可用引物進行擴增，又可以揭示比RFLP、RAPD、

4、SSR更多的多態(tài)性，現(xiàn)已在遺傳多樣性、種植資源鑒定、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、基因定位、系統(tǒng)發(fā)育等方面被廣泛應(yīng)用 ，本文主要對ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的原理、操作及其在果樹遺傳、進化等領(lǐng)域的應(yīng)用作簡要介紹。1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理和特點1.1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的原理 在真核生物基因組中均存在著由14個核苷酸組成的簡單重復(fù)序列4，如(A)n、(AG)n、(AGC)n、(AATT)n等。植物基因組中最多的SSR是(AT)n、(TA)n、( GA)n、(CT)n等二核苷酸重復(fù)序列5。ISSR技術(shù)的基本原理就是在SSR的3或5端錨定14個嘌呤或嘧啶堿基, 然后以此為引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR間

5、的一段DNA進行PCR擴增,而不是擴增SSR本身。如圖1-1。 5錨定引物NNNN(CA)n3錨定引物NN(CA)nCACACACACACACACAGTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA5錨定引物NNNN(CA)n3錨定引物NN(CA)n3錨定引物的PCR產(chǎn)物5錨定引物的PCR產(chǎn)物圖1-1 用重復(fù)序列(CA)n作單引物，在引物的5端或3錨定1至數(shù)個堿基1.2 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的特點 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種在PCR中直接使用微衛(wèi)星序列進行DNA 擴增的分子標(biāo)記技術(shù)。它具有以下特點:

6、(1)實驗操作簡單、快速、高效，不需要繁瑣的構(gòu)建基因文庫、雜交和同位素示蹤等操作，DNA用量少,引物設(shè)計容易,實驗成本低廉。(2)擴增基因組DNA，適應(yīng)于任何富含SSR重復(fù)單元和SSR廣泛分布的物種，可同時提供多位點信息和揭示不同微衛(wèi)星座位個體變異的信息。(3)ISSR分子標(biāo)記為顯性標(biāo)記,符合孟德爾式遺傳規(guī)律6。(4)遺傳多態(tài)性好，重復(fù)性好。引物較長,通常為1625bp,而RAPD的引物只有10bp；PCR擴增時的退火溫度較高，因此引物具有更強的專一性，與模板結(jié)合的強度提高，降低了雜帶的干擾，提高了實驗結(jié)果的可復(fù)性。但ISSR分子標(biāo)記技術(shù)也有不足之處，其不足之處在于：PCR擴增反應(yīng)的最適條件需

7、要一定時間的摸索；ISSR標(biāo)記大多為顯性遺傳標(biāo)記,不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。2 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)實驗操作7ISSR分子技術(shù)也主要包括DNA樣品的提取、PCR擴增、電泳檢測、觀察結(jié)果及統(tǒng)計分析等步驟。2.1 DNA樣品的提取提取植物DNA的方法有很多，用于ISSR分子標(biāo)記的DNA樣品的提取方法有：SDS法、CTAB法。雖然不需要用試劑盒對所提取的DNA進行純化，但仍需對DNA樣品進行電泳，檢測其質(zhì)量，并用紫外分光光度計檢測DNA與蛋白質(zhì)的比值。根據(jù)需要用無菌水將DNA稀釋到所需濃度（10ngul），貯存在-2O 或-70冰箱中備用。2.2 引物設(shè)計引物設(shè)計是ISSR技術(shù)中最關(guān)鍵、最

8、重要的一步。用于ISSR的引物常為5端或3端加錨的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)一般為48次，使引物的總長度達到20bp左右。5端或3端用于錨定的堿基數(shù)目一般為14個，錨定的目的是引起特定位點退火，使引物與相匹配SSR的一端結(jié)合，而不是中間，從而對基因組中特定片段進行擴增、檢測。2.3 PCR擴增反應(yīng)在確定了引物之后，就可以在PCR儀上對基因組中的SSR間序列進行擴增了。擴增步驟主要為變性（denaturation）、退火（anealing）、延伸(extension)，擴增步驟與RAPD技術(shù)相似,但不同引物、不同材料的擴增條件有異。以25ulPCR反應(yīng)體系為例，一般含0.20

9、.8mol/L引物, 550ng模板DNA和0.41.0 U Taq DNA聚合酶, PCR反應(yīng)緩沖液,四種dNTP,需要做預(yù)備實驗優(yōu)化PCR條件,以獲得清晰、可重復(fù)、易統(tǒng)計的條帶。2.4 PCR產(chǎn)物的電泳與數(shù)據(jù)分析 PCR產(chǎn)物需經(jīng)電泳分離、染色顯示后才能進行條帶觀察、統(tǒng)計。目前可用于ISSR擴增產(chǎn)物分離的電泳有：濃度為1.5%2.0%瓊脂糖凝膠電泳或濃度為6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，后者的分離效果通常更好。用溴化乙錠(EB)或硝酸銀染色后，在紫外光(EB染色)或可見光(銀染)下進行觀察，統(tǒng)計帶紋的有(計為1)或無(計為O)及相對位置，然后即可根據(jù)研究目的，應(yīng)用UPGMA、SPSS等聚類分析軟件進

10、行分析。3 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在果樹遺傳學(xué)的應(yīng)用ISSR技術(shù)由于引物較長，退火溫度較高，這就增強了實驗的可重復(fù)性，同時實驗操作簡單、快速、高效，不需要繁鎖的構(gòu)建文庫、設(shè)計引物、雜交、同位素顯示等步驟，而且ISSR標(biāo)記可以揭示整個基因組的一些特征，并呈孟德爾式遺傳，因此該技術(shù)一問世就在植物遺傳分析中得到了廣泛應(yīng)用。3.1 遺傳多樣性 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在果樹遺傳多樣性的應(yīng)用非常廣泛。彭瑜8等利用ISSR分子標(biāo)記方法對20個柚類品種進行遺傳多樣性研究，揭示了柚類品種間豐富的遺傳多樣性。張如蓮9等利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對香蕉30個品種的遺傳多樣性進行了分析。通過聚類分析,所得結(jié)果與香蕉在形態(tài)學(xué)

11、上的分類基本符合, 只有幾個品種的分類有一定的差異,充分顯示應(yīng)用ISSR技術(shù)可以有效地進行香蕉品種鑒別,澄清引種過程中出現(xiàn)的同物異名、同名異物現(xiàn)象,以及為香蕉新品種選育的早期選擇及雜交親本的選配提供依據(jù), 實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種等。余賢美10等采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對海南、云南、廣西3省的12個芒果野生居群共265個個體的遺傳多樣性水平及居群遺傳結(jié)構(gòu)進行研究。廣西的3個居群(那坡、邕寧、平南) 優(yōu)先與云南的文山居群聚為一支；而云南的永德和版納居群各自聚為一支。 魏守興11等從74條引物中篩選出23條多態(tài)性引物,用ISSR方法對80份海南荔枝種質(zhì)進行分子標(biāo)記分析和遺傳多樣性研究。結(jié)果表明, 大多數(shù)種

12、質(zhì)的遺傳距離在0.12-0.15之間,說明它們的親緣關(guān)系較近。在遺傳距離為0.55的水平上,80份荔枝種質(zhì)被分為7組,海墾8號、瓊山3號與永25單獨為一組,可能屬于海南的地方種質(zhì)。另外,通過與SSR, RAPD等方法對比,ISSR方法應(yīng)用前景較好。鄒游12等利用ISSR技術(shù)對采自四川省獼猴桃科研基地的14個獼猴桃品種進行了遺傳多樣性分析。ISSR標(biāo)記說明獼猴桃品種間遺傳距離與地理分布有一定關(guān)系, 地理位置較近的品種能聚在一起。3.2 種質(zhì)資源鑒定與親緣關(guān)系果樹生命周期長，并長期通過無性方式繁殖，加上不同地域間的相互引種，使同名異物和同物異名現(xiàn)象十分普遍，如何準(zhǔn)確地對現(xiàn)有果樹品種鑒定和親緣關(guān)系分

13、析，是進一步科學(xué)、有效地利用果樹資源的基礎(chǔ)。借助ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，可以在大范圍內(nèi)對果樹的遺傳物質(zhì)進行較全面的比較，從而對果樹種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析。Fang等13用ISSR指紋圖譜鑒定了柑桔屬(Citrus)不同品種， 通過22個引物產(chǎn)生的ISSR標(biāo)記可用于區(qū)分68個柑桔品種。吳興恩等14對富民枳、枳、枳橙和甜橙等22份柑桔資源進行了ISSR分析,并對所得結(jié)果進行了討論，發(fā)現(xiàn)采用ISSR技術(shù)可作為品種鑒別、親緣關(guān)系和分類的手段之一。徐志祥等15ISSR分子標(biāo)記對南豐柑桔品種的遺傳多樣性進行研究。從100個ISSR引物中篩選出17個多態(tài)引物，對14份柑桔樣品進行ISSR-PCR分析。UP

14、GMA聚類分析結(jié)果表明，以遺傳相似系數(shù)為0.67為分界線，可以將14份供試柑桔樣品分成三類：第一類包含以ss-28為代表的7個柑桔品種；第二類包含以楊小2,6 為代表的3個柑桔品種；第三類包括以早系97-1 為代表的4個柑桔品種。 果樹種質(zhì)資源的鑒定和評價對于育種親本選擇、豐富遺傳基礎(chǔ)以及種質(zhì)資源合理利用開發(fā)等方面都是非常重要的。以往根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、農(nóng)藝性狀、同工酶標(biāo)記進行鑒定分類, 但基因型與環(huán)境互作使這些鑒定方法受到了許多限制, ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)具備高效、準(zhǔn)確、不受環(huán)境及主觀因素影響等特點。3.3 遺傳指紋圖譜的構(gòu)建 果樹遺傳指紋圖譜研究技術(shù)是在現(xiàn)代儀器分析技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,

15、 進而對果樹進行鑒定和質(zhì)量控制。研究方法也有多種, 分別從不同的角度反映了果樹的遺傳信息。ISSR標(biāo)記容易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，敏感性高，通過ISSR分析可以找出與靶基因連鎖的ISSR標(biāo)記。ISSR標(biāo)記在雜交群體中呈孟德爾式分離，ISSR遍布基因組，多態(tài)性高，因此可用于遺傳作圖。Sankar等16對用ISSR在柑橘作圖中效果評價，認為ISSR 標(biāo)記符合孟德爾式分離，標(biāo)記是顯性標(biāo)記，少部分標(biāo)記呈共顯性分離， 可以同RFLP、RAPD、同工酶的遺傳圖譜相互補充，構(gòu)建新的遺傳圖譜，因此ISSR適合柑橘的遺傳圖譜構(gòu)建。 姜帆17等以立冬本龍眼DNA為模板研究了龍眼ISSR-PCR反應(yīng)體系的主要成分對ISSR擴增

16、結(jié)果的影響,并探討了構(gòu)建龍眼指紋圖譜的可行性, 利用豐富的多態(tài)性DNA譜帶構(gòu)建了12個基因型龍眼的指紋圖譜。劉威生18等在優(yōu)化的反應(yīng)條件下建立了5個種12份杏材料的ISSR的指紋圖譜。雷天剛等19利用SSR標(biāo)記和ISSR 標(biāo)記對102個柑橘栽培品種進行DNA指紋分析，篩選適合的特征引物，構(gòu)建柑橘栽培品種的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。4.結(jié)論綜上所述，ISSR標(biāo)記因其引物容易設(shè)計，實驗重復(fù)性強，操作過程簡單，不須使用同位素，可以揭示更高程度的DNA多態(tài)性，從而在果樹遺傳研究中具有廣闊的應(yīng)用前景，但任何一種分子標(biāo)記都不能解決所有問題，在今后的研究工作中，我們應(yīng)根據(jù)自己的研究目的，選擇合適的分子標(biāo)記，或?qū)⒉煌瑯?biāo)

17、記結(jié)合起來進行綜合研究。ISSR標(biāo)記技術(shù)在果樹遺傳育種中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)然ISSR標(biāo)記亦存在一些缺點, 限制了其在某些方面的應(yīng)用。ISSR標(biāo)記以其多態(tài)性高、可重復(fù)性強、簡便快速等優(yōu)勢, 必將使其在果樹種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)發(fā)育研究、育種材料早期選擇等方面發(fā)揮更大的作用。參考文獻1王建波，ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用，2002，24(5)：6136162MeyerW,Mitchell T G, Freedman E Z, et al. Hybridization probes for conventional DNA fingerprinting used as single prim

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