蛋白質(zhì)工程2016

1、2021-11-161一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述2021-11-163全球生物制藥的市場快速增長，目全球生物制藥的市場快速增長，目前已達前已達1970億美元，其中億美元，其中重組蛋白重組蛋白和抗體類藥物和抗體類藥物占絕大部分。占絕大部分。截止到截止到2012年，在歐洲或美國獲準年，在歐洲或美國獲準上市的上市的430多種生物藥品中，多種生物藥品中，超過超過300 種是重組蛋白和抗體藥物。種是重組蛋白和抗體藥物。據(jù)統(tǒng)計，截止據(jù)統(tǒng)計，截止 2013年，年，超過超過900種種基于蛋白和多肽類的藥物基于蛋白和多肽類的藥物正處于研正處于研究和開發(fā)階段，用于治療超過究和開發(fā)階段，用于治療超過100

2、種疾病。種疾病。一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述胰島素是糖尿病治療的最有效藥物胰島素是糖尿病治療的最有效藥物豬豬人人 全球已診斷的型糖尿病患者達1.3億人，我國已超過4000萬人.中國城市人口治療糖尿病每年直接人均醫(yī)療花費為451美元，治療患有糖尿病并發(fā)癥的患者花費則高達1694美元。在糖尿病用藥中，胰島素是最有效的糖尿病治療藥物之一，也是1型糖尿病人惟一的治療藥物。此外，還有30%40%的2型糖尿病患者最終需要使用胰島素。 4一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述速效胰島素速效胰島素-人胰島素的類似物人胰島素的類似物天然胰島素的缺點天然胰島素的缺點:皮下組織內(nèi)容易自身聚合因為皮下注射的藥用

3、濃度遠高于生理濃度，導致吸收起效變慢，患者必須餐前提前30min注射。解決思路：解決思路：鑒于胰島素樣生長因子IGF-1在組織液中是以單體形式存在,將胰島素B鏈的B28-B29的殘基序列顛倒成IGF-1 相應序列或向胰島素引入帶電荷或具有大的側(cè)鏈的殘基,以阻礙二聚體的形成。5一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述ProThrGlyTyrPhePhe GlyArgGluGlyValLeuTyrLeuAlaGluValLeuHisSerGlyCysLeuHisGlnAsnValPheB1A21B28B30A1AsnTyrAsnGluLeuGlnTyrLeuSerLieSerThrCysGlnGluV

4、alLieCysCysCysCysThrLysProAsp 將人胰島素將人胰島素B28氨基酸變成為門冬氨基酸（氨基酸變成為門冬氨基酸（Asp）后形成人胰）后形成人胰島素類似物，取名為門冬胰島素。門冬胰島素是速效胰島素。島素類似物，取名為門冬胰島素。門冬胰島素是速效胰島素。課堂互動：不同蛋白質(zhì)的課堂互動：不同蛋白質(zhì)的PIPI不同，含堿性氨基酸多的蛋白質(zhì)不同，含堿性氨基酸多的蛋白質(zhì)PIPI較高，含酸性氨較高，含酸性氨基酸多的蛋白質(zhì)基酸多的蛋白質(zhì)PIPI較低。門冬胰島素比人胰島素多了一個天冬氨酸，其較低。門冬胰島素比人胰島素多了一個天冬氨酸，其PIPI會偏會偏高還是低？這有怎樣的藥理學意義？高還是低

5、？這有怎樣的藥理學意義？一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述門冬胰島素不需要糖尿病患者飯前門冬胰島素不需要糖尿病患者飯前30min打針！打針！一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述8胰島素的緩釋改造胰島素的緩釋改造-超長效胰島素超長效胰島素改造的意義：胰島素屬小分子蛋白,皮下注射進入血液后被快速代謝, 給藥頻繁。維持血藥濃度,防止胰島素濃度過高造成低血糖。對于胰島素基礎分泌缺損的患者最有意義。一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述9 地特胰島素是長效胰島素20132013年銷售額年銷售額1818億美元億美元一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述 甘精胰島素，甘精胰島素，也是長效胰島素，每天一針可以滿

6、足也是長效胰島素，每天一針可以滿足患者一天的基礎胰島素需要患者一天的基礎胰島素需要不同項不同項甘精胰島素甘精胰島素人胰島素人胰島素A21GlyL-AsnB30兩個兩個L-ArgL-Thr結(jié)構特點：結(jié)構特點：分析：分析： 天冬酰胺是天冬酰胺是中性中性大側(cè)鏈大側(cè)鏈氨基酸而氨基酸而甘氨酸（甘氨酸（GlyGly）是中性）是中性小側(cè)鏈小側(cè)鏈氨基酸氨基酸l 這一變化使得分子間聚合的空間位阻減小，這一變化使得分子間聚合的空間位阻減小，容易聚合。容易聚合。 蘇氨酸（蘇氨酸（ThrThr）是中性氨基酸而精氨酸是堿性氨基酸）是中性氨基酸而精氨酸是堿性氨基酸l 這一變化這一變化使得分子的使得分子的PIPI提高，接近

7、于體液的中性環(huán)境，使得該分提高，接近于體液的中性環(huán)境，使得該分子在體液環(huán)境下子在體液環(huán)境下帶電減少，容易聚合。帶電減少，容易聚合。一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程的概念簡言之就是按人們意志改變蛋白質(zhì)的結(jié)構和功能或創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)簡言之就是按人們意志改變蛋白質(zhì)的結(jié)構和功能或創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)的過程。的過程。基于對蛋白質(zhì)結(jié)構、理化特性、生物學功能及生物合成等研究，通過生物技術手段有目的地改造蛋白質(zhì)或制造一種全新的蛋白質(zhì)的過程。因為需要利用生物技術手段對蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進行有目的的改造，被稱為“第二代基因工程第二代基因工程”。一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述基因工程

8、基因工程蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程相同點相同點都要改造基因，都屬于分子水平都要改造基因，都屬于分子水平產(chǎn)生的基因產(chǎn)生的基因無新基因無新基因有新基因有新基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)原有的原有的新的新的聯(lián)系聯(lián)系蛋白質(zhì)工程是基因工程的應用和延伸蛋白質(zhì)工程是基因工程的應用和延伸蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)工程與基因工程基因工程12一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述13一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述新蛋白產(chǎn)生途徑新蛋白產(chǎn)生途徑自然突變：基因的自然突變率極低，會產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)（自然進化）。自然突變：基因的自然突變率極低，會產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)（自然進化）。蛋白質(zhì)工程：通過基因的突變技術有目的性的改造蛋白質(zhì)，速度遠比自蛋

9、白質(zhì)工程：通過基因的突變技術有目的性的改造蛋白質(zhì)，速度遠比自然進化快。然進化快。酶工程與蛋白質(zhì)工程的比較酶工程與蛋白質(zhì)工程的比較酶工程：酶工程：重點在于對已存酶的合理充分利用和大量制備。重點在于對已存酶的合理充分利用和大量制備。蛋白質(zhì)工程：蛋白質(zhì)工程：重點則在于對已存在的蛋白質(zhì)分子的改造。隨著蛋白質(zhì)工重點則在于對已存在的蛋白質(zhì)分子的改造。隨著蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，其成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質(zhì)工程的一程的發(fā)展，其成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質(zhì)工程的一部分。部分。14一、蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程概述 需要是創(chuàng)新的第一動力，需要是創(chuàng)新的第一動力， 需求是發(fā)明創(chuàng)造的源泉和方

10、向，需求是發(fā)明創(chuàng)造的源泉和方向， 而科學的知識是發(fā)明創(chuàng)造的工具。而科學的知識是發(fā)明創(chuàng)造的工具。15二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展課堂討論：對此你有深切的感受嗎課堂討論：對此你有深切的感受嗎? ?讓讓你思想的你思想的“火化火化”照亮我們混沌的照亮我們混沌的心路。心路。medicationDEMANDSl蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性l半衰期l不良反應l免疫原性16二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展Catalyst for industriesDEMANDSl熱穩(wěn)定性l化學穩(wěn)定性l壓力穩(wěn)定性l催化效率17二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展Agricul

11、ture DEMANDSl生物學活性l穩(wěn)定性Cow-Henry from Roslin InstituteMilk with high concentration of a1-antitrypsin18二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展 Francis Crick, James Watson, 19621968 Robert Holley, Gobind Khorana, Marshall Nirenberg1933 Thomas Hunt Hunt Morgan 19生物技術的發(fā)展是蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生的基礎生物技術的發(fā)展是蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生的基礎二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)

12、工程的產(chǎn)生與發(fā)展Werner Arber ,1978, restriction enzymesMichael Smith,1993, Point mutationFrederick Sanger ,1980, DNA SequencingSevero Ochoa, 1959, Synthesis of RNAKary B. Mullis, 1993, PCR20二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展Gerald M. Edelman,1972, Antibody structure Frederick Sanger, 1958, Structure of insulin Bruc

13、e Merrifield, 1984, Peptide Synthesis21二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展John B. Fenn, Koichi Tanaka, Kurt Wthrich, 2002, Mass and NMR Herbert A. Hauptman, Jerome Karle, 1985, X-Ray Crystal22二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)工程的產(chǎn)生與發(fā)展蛋白質(zhì)結(jié)構與功能分析蛋白質(zhì)結(jié)構與功能分析 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構與功能的設計與預測結(jié)構與功能的設計與預測 改造或創(chuàng)造新蛋白質(zhì)改造或創(chuàng)造新蛋白質(zhì)三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)

14、容231 1、蛋白質(zhì)結(jié)構與功能分析蛋白質(zhì)結(jié)構與功能分析（研究核心）研究核心）獲取大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構的信息獲取大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構的信息形成蛋白質(zhì)結(jié)構與功能之間關系的數(shù)據(jù)形成蛋白質(zhì)結(jié)構與功能之間關系的數(shù)據(jù)形成蛋白質(zhì)結(jié)構與功能之間關系的理論形成蛋白質(zhì)結(jié)構與功能之間關系的理論三維空間結(jié)構的測定：證明新結(jié)構改變了原有生物功能的必需三維空間結(jié)構的測定：證明新結(jié)構改變了原有生物功能的必需手段手段 24三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容晶體學分析技術（晶體學分析技術（x x射線晶體結(jié)構分析）射線晶體結(jié)構分析）對分析樣品的要求：對分析樣品的要求：l高度的均一性。影響樣品高度的均一性。影響樣品均

15、一性均一性因素：因素：金屬離子、輔酶或一些成鍵的輔助基團的變化或缺失；金屬離子、輔酶或一些成鍵的輔助基團的變化或缺失；蛋白質(zhì)的酶解、氧化和還原；蛋白質(zhì)的酶解、氧化和還原；蛋白質(zhì)的聚合效應等。蛋白質(zhì)的聚合效應等。l晶體生長的生化條件：晶體生長的生化條件：pHpH值、離子強度、沉淀劑和添加劑的濃值、離子強度、沉淀劑和添加劑的濃度等因素度等因素缺陷：需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克缺陷：需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克- -幾十毫克），制備幾十毫克），制備出單晶體，然后再進行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計算和分析出單晶體，然后再進行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計算和分析蛋白質(zhì)結(jié)構分析主要技術蛋白質(zhì)結(jié)構分析主要技術25三

16、、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容多維核磁共振波譜技術多維核磁共振波譜技術 二維同核核磁共振方法：對氫原子核的二維核磁共振信號進行分析，主要用于類蛋白質(zhì)。 多維異核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白質(zhì)和螺旋的多肽 進行分析。冷凍電鏡冷凍電鏡技術技術 避免了普通電鏡制樣的脫水過程，不破壞蛋白正常結(jié)構并且分辨率更高，尤其適用于大分子蛋白復合體的結(jié)構解析。26蛋白質(zhì)結(jié)構分析主要技術蛋白質(zhì)結(jié)構分析主要技術三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容27施一公施一公 1.Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 A

17、ngstrom Resolution, 10.1126/science.aac7629 2. Structural basis of pre-mRNA splicing. 10.1126/science.aac8159三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容蛋白質(zhì)空間結(jié)構的測定已經(jīng)成為生命科學的“瓶頸”美國NIH投資1.25億美元，計劃測定1萬個蛋白質(zhì)晶體結(jié)構；日本RIKEN將建16臺高分辨率核磁共振儀，用來測定小分子蛋白質(zhì)結(jié)構技術上的障礙：在克隆、表達、純化和結(jié)晶過程中，大約20個蛋白質(zhì)中能得到1個可供結(jié)構測定的晶體，并且一些蛋白質(zhì)（膜蛋白）根本不可能被結(jié)晶現(xiàn)階段主要研究手段：根據(jù)氨

18、基酸序列從理論上計算其相應空間結(jié)構成為蛋白質(zhì)領域內(nèi)科學家們的奮斗目標研究現(xiàn)狀28三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容2 2、結(jié)構與功能的設計與預測、結(jié)構與功能的設計與預測 通過對天然蛋白質(zhì)結(jié)構與功能分析，建立起蛋白質(zhì)結(jié)構與功能數(shù)據(jù)庫。利用此數(shù)據(jù)庫，通過比對檢索，可以預測某一氨基酸序列的肽鏈可能形成的空間結(jié)構和具備的生物學功能。同理，根據(jù)特定的生物功能，可以設計蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構 。29三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容生物信息學分析技術生物信息學分析技術蛋白質(zhì)結(jié)構的預測和設計：蛋白質(zhì)結(jié)構的預測和設計：30三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容三、蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容物理、

19、化學法：對蛋白質(zhì)進行變性、復性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質(zhì)形成一定的立體構像等等生物化學法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學基團，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等 基因重組技術或人工合成DNA：可以改造蛋白質(zhì)而且可以實現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質(zhì) 313 3、改造或創(chuàng)造新蛋白質(zhì)、改造或創(chuàng)造新蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)改造的基本路徑蛋白質(zhì)改造的基本路徑 分離純化分離純化目標蛋白質(zhì)目標蛋白質(zhì) 分析分析 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構一級結(jié)構 分析分析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構及結(jié)構與功能的關系結(jié)構與功能的關系根據(jù)蛋一級結(jié)構設計根據(jù)蛋一級

20、結(jié)構設計引物、克隆目的基因引物、克隆目的基因根據(jù)三維結(jié)構和結(jié)構與根據(jù)三維結(jié)構和結(jié)構與功能的關系及蛋白質(zhì)改功能的關系及蛋白質(zhì)改造的目的設計改造方案造的目的設計改造方案對目的基因?qū)δ康幕蚨c突變定點突變改造后的基改造后的基因在宿主細因在宿主細胞中表達胞中表達分離純化表分離純化表達的蛋白質(zhì)達的蛋白質(zhì)分析功能和評價分析功能和評價是否達到設計目的是否達到設計目的32 蛋白質(zhì)組學、生物信息學等學科的發(fā)展為蛋白質(zhì)工程提供了必要的基礎：蛋白質(zhì)組學：蛋白質(zhì)組學：蛋白質(zhì)組學是闡明生物體各種生物基因組在細胞中表達的全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式的學科;包括鑒定蛋白質(zhì)的表達、存在方式（修飾形式）、結(jié)構、功能和相互作

21、用等。生物信息學：生物信息學：是以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學。l水蛭素改造水蛭素在臨床上可作為水蛭素在臨床上可作為抗栓藥物抗栓藥物用于治療血栓疾病。用于治療血栓疾病。水蛭素是水蛭唾液腺分泌的水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑凝血酶特異抑制劑，它有多種變異體，它有多種變異體，由由6565或或6666個氨基酸殘基組成。個氨基酸殘基組成。在綜合各變異體結(jié)構特點的基礎上提出改造水蛭素主要變異體在綜合各變異體結(jié)構特點的基礎上提出改造水蛭素主要變異體HV2HV2的設計方案：的設計方案：將將4747位的位的AsnAsn（天冬酰胺）變成（天冬酰胺）變成LysLys（賴氨酸），使其與

22、分子內(nèi)第（賴氨酸），使其與分子內(nèi)第4 4或第或第5 5位位ThrThr（蘇氨酸）間形成氫鍵來幫助水蛭素（蘇氨酸）間形成氫鍵來幫助水蛭素N N端肽鏈的正確取向，從而提端肽鏈的正確取向，從而提高抗凝血效率高抗凝血效率試管試驗活性提高試管試驗活性提高4 4倍倍在動物模型上檢驗抗血栓形成的效果，提高在動物模型上檢驗抗血栓形成的效果，提高2020倍。倍。三、蛋白質(zhì)工程的應用實例分析三、蛋白質(zhì)工程的應用實例分析l生長激素的改造生長激素的改造生長激素的功能特點：結(jié)合生長激素的功能特點：結(jié)合生長激素受體，生長激素受體，促進細胞和機體的生促進細胞和機體的生長發(fā)育；結(jié)合許多種不同類型細胞的長發(fā)育；結(jié)合許多種不同類型細胞的催乳激素受體催乳激素受體，引發(fā)其他生，引發(fā)其他生理過程。理過程。改造目標及方法：只與生長激