N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖N,O-羧甲基殼聚糖新城疫減毒活疫苗納米粒的制備方法1

1、N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖新城疫減毒活疫苗納米粒的制備方法摘要：本發(fā)明提供了一種N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖負(fù)載新城疫病毒納米粒的制備方法。目前，疫苗黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究日益得到廣泛關(guān)注，然而，疫苗具有在體內(nèi)降解和消除快、生物利用度低，體內(nèi)半衰期短、需要佐劑和反復(fù)注射接種，副作用大、程序繁瑣等缺點(diǎn)。另外，目前，大部分動物病毒?。ㄈ珉u新城疫、禽流感等）的滅活疫苗雖然能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的血清循環(huán)抗體IgG，但不能誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答，也就不能阻止病毒的感染。利用可生物降解高分子材料納米粒對疫苗進(jìn)行包裹，不僅可以保護(hù)疫苗完成投遞過程，避免體內(nèi)酸堿環(huán)境

2、和酶類對抗原的破壞，而且能使抗原的釋放方式、速度、部位等具有一定的選擇性和可控性，利于實(shí)現(xiàn)疫苗的控制釋放和靶向傳輸，為疫苗劑型和免疫途徑的多樣化提供了廣闊的前景。同時(shí)，納米粒還具有佐劑作用，能增強(qiáng)疫苗的抗原性，并優(yōu)化免疫應(yīng)答的類型，從而提高接種效率、增強(qiáng)免疫效果。但是，作為黏膜免疫的遞送載體，需具備永久正電性和生理環(huán)境下的水溶性，因?yàn)檫@樣可有效地降低跨上皮細(xì)胞電阻，打開上皮細(xì)胞的緊密連接，通過細(xì)胞旁路增加親水性載藥納米粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高納米粒的攝取率。本發(fā)明以改性的殼聚糖N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（N-2-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride c

3、hitosan，N-2-HACC）、N,O-羧甲基殼聚糖（N,O-carboxymethyl chitosan，N,O-CMC）為原料，以新城疫病毒（NDV）為模型藥物，采用聚電解質(zhì)復(fù)合法制備載新城疫減毒活疫苗N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。本發(fā)明制備的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs具有良好的相容性和生物黏附性，克服了傳統(tǒng)注射疫苗造成的順應(yīng)性差、注射器和針頭導(dǎo)致感染、減活疫苗在儲存和運(yùn)輸過程中易失活等缺點(diǎn)，且制備方法簡單易行，條件溫和，生產(chǎn)成本較低、易于規(guī)模化生產(chǎn)。權(quán)利要求書一種N-2-羥丙基三

4、甲基氯化銨殼聚糖和N,O-羧甲基殼聚糖的合成及N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖新城疫減毒活疫苗納米粒，其特征在于包括以下步驟：1、N-2-HACC合成采用ETA與殼聚糖的氨基開環(huán)反應(yīng)合成N-2-HACC。 2、N,O-CMC合成采用氯乙酸法將殼聚糖堿化膨脹后與氯乙酸反應(yīng)合成N,O-CMC。3、NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs制備 采用聚電解質(zhì)復(fù)合的方法制備N-2-HACC/N,O-CMC-NPs。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-2-HACC的合成方法，其特征在于該方法的具體步驟為：（1）殼聚糖的脫乙?；幚韺⒚撘阴６葹?5%殼聚糖分散在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% NaO

5、H異丁醇溶液中，100條件下回流攪拌反應(yīng)1h，傾去上清液，去離子水洗至中性；之后，再將殼聚糖分散在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%NaOH異丙醇溶液中，繼續(xù)回流攪拌反應(yīng)1.5h，傾去上清液，去離子水洗至中性。 （2）殼聚糖的浸泡處理將脫乙酰處理的殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為1%乙酸溶液中，攪拌溶解，真空抽濾，濾去不溶物；之后，在500-1000r/min攪拌條件下逐滴加入0.1mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH=9，逐漸有白色沉淀析出，浸泡8h，抽濾，去離子水洗至濾液呈中性，抽干水分；最后，向?yàn)V餅中加入15mL異丙醇，攪拌30min、分散均勻，倒入三口燒瓶。（3）殼聚糖與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（ETA

6、）開環(huán)反應(yīng)在N2保護(hù)條件下，將三口燒瓶升溫至80，逐滴加入ETA的異丙醇溶液（9g/50mL），30min內(nèi)滴完；反應(yīng)12h后將三口燒瓶冷卻至室溫，加入150mL冷藏處理的無水乙醇，浸泡0.5h，抽濾，冷凍干燥24h。（4）N-2-HACC精制將干燥后的N-2-HACC溶于去離子水中；之后，采用3G砂芯漏斗過濾，將濾液在5倍體積冷藏處理的丙酮中沉淀；真空抽濾，濾餅分散后冷凍干燥24h；分裝，充入N2密封室溫保存。 5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的N,O-CMC的合成方法，其特征在于該方法的具體步驟為：（1） 溶脹 準(zhǔn)確稱取5g粉末狀殼聚糖置于250mL三口燒瓶中，加入40mL異丙醇，攪拌，浸泡2h。（

7、2） 堿化 向反應(yīng)器中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%NaOH溶液60mL，攪拌均勻后浸泡2h，得堿化殼聚糖。（3） 羧甲基化 準(zhǔn)確稱取20g氯乙酸，在攪拌狀態(tài)下分?jǐn)?shù)次加入到堿化殼聚糖中，60、反應(yīng)8h，制得粗產(chǎn)品。（4） 精制 把粗產(chǎn)品用一定量的乙醇洗滌幾次，除去醋酸鈉、氯化鈉等鹽類，抽濾后于60下干燥24h，得精制品。6、根據(jù)制備權(quán)利要求3所述的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為：（1）取1mg/mL N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液5mL，向其中緩慢滴加入2mL新城疫L-系病毒液（病毒含量為108.5EID50），磁力攪拌3min混合均勻；（

8、2）在室溫、無菌條件下，1200r/min磁力攪拌30min后，向其中勻速緩慢滴加入1mg/mLN,O-羧甲基殼聚糖溶液2mL；（3）將該溶液于4、12000r/min離心2min，沉淀經(jīng)去離子水洗三次，真空冷凍干燥24h，即得負(fù)載新城疫減毒活疫苗N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。7、根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于權(quán)利要求4的步驟（1）所述的殼聚糖脫乙?；幚淼木唧w過程為：將脫乙酰度85%殼聚糖分散在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% NaOH異丁醇溶液中，100條件下回流攪拌反應(yīng)1h，傾去上清液，去離子水洗至中性；之后，

9、再將殼聚糖分散在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% NaOH異丁醇溶液中，100條件下繼續(xù)回流攪拌反應(yīng)1.5h，傾去上清液，去離子水洗至中性。 殼聚糖脫乙酰采用間歇法或連續(xù)法，用NaOH異丁醇溶液處理。NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%-40%，異丁醇的量為每克殼聚糖加入10-30mL，處理溫度為90-120，處理時(shí)間為1.5-8h。8、根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于權(quán)利要求4的步驟（2）所述的乙酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為1%-3%，使用0.1mol/L-2.0mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH使殼聚糖析出，析出后的殼聚糖經(jīng)過浸泡處理，去離子水洗滌后加入了異丙醇分散均勻成漿狀。9、根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，

10、其特征在于權(quán)利要求4的步驟（3）所述的ETA與殼聚糖的質(zhì)量比為11-91。采用分批加料的方式逐滴加入ETA的異丙醇溶液，整個反應(yīng)在N2保護(hù)條件下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入冷藏處理的無水乙醇浸泡，抽濾后使用冷凍干燥。10、根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于權(quán)利要求4的步驟（3）所述的反應(yīng)溫度為75-85，反應(yīng)時(shí)間為8-14h。11、根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于權(quán)利要求4的步驟（4）所述的N-2-HACC采用去離子水溶解，3G砂芯漏斗過濾，冷藏處理的丙酮沉淀的方法進(jìn)行精制。12、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求5的步驟（1）所述的浸泡時(shí)間為1-12h。13、

11、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求5的步驟（2）所述的NaOH用量為10-40g，浸泡時(shí)間2-24h。14、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求5的步驟（3）所述的氯乙酸/殼聚糖（v/w）分別為2.51到17.51，反應(yīng)時(shí)間為2-10h，反應(yīng)溫度為40-80。15、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求5的步驟（4）所述的濾液中加入4倍量的無水乙醇充分沉淀，過濾，95%乙醇溶液洗滌，所得產(chǎn)品放入30-60真空干燥箱內(nèi)干燥6-24h。16、根據(jù)權(quán)利要求3、6所述的方法，其特征在于所述的模型藥物為20-300nm的L系新城疫病毒粒子。17、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述

12、的方法，其特征在于權(quán)利要求6的步驟（1）所述的模型藥物新城疫病毒液在制備納米粒子前經(jīng)過了去離子化處理。18、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求6的步驟（1）所述的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液濃度可為0.5-20mg/mL。19、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求6的步驟（1）所述的投藥量可為1.25-7.5mL。20、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求6的步驟（2）所述的N,O-羧甲基殼聚糖溶液濃度可為0.5-3.0mg/mL。21、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求6的步驟（3）所述的攪拌速度可為900-1300r/min。22

13、、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求6的步驟（2）所述的攪拌時(shí)間可為10-40min。23、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs制備完成后離心，用去離子水洗滌三次。24、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs制備完成后冷凍干燥。25、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于制備的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs粒徑為120-500nm。26、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于所述的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs表面電位為15-60mv。27

14、、根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法，其特征在于所述的納米粒子的包封率在90%以上，載藥量在45%以上。說明書技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖和N,O-羧甲基殼聚糖的合成方法及N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖新城疫減毒活疫苗納米粒的制備方法。背景技術(shù)新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一種急性、高度接觸性、致死性禽類傳染病，該病在雛雞、火雞、鴿、鶴、鵪鶉和鸚鵡等其它鳥類中能引起100%發(fā)病和死亡。該病的主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血，發(fā)病急、致死

15、率高，是危害養(yǎng)禽業(yè)的最嚴(yán)重傳染病之一。目前，該病的預(yù)防和控制的最重要和最有效的手段是接種疫苗。但是，現(xiàn)有疫苗的普遍缺點(diǎn)是免疫原性較弱，需用較強(qiáng)的免疫佐劑或合適的黏膜免疫傳遞系統(tǒng)才能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。納米疫苗是一種運(yùn)用可降解生物材料和納米技術(shù)改進(jìn)現(xiàn)有疫苗的劑型和投遞方式，從而保護(hù)抗原、簡化接種程序、提高免疫效果的新型緩釋疫苗，而且也解決了傳統(tǒng)給藥方式所帶來的給藥不便和藥物濃度不穩(wěn)定的問題，降低了藥物的毒性，提高了藥物的療效。殼聚糖作為自然界唯一帶有陽離子的天然多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性以及抗菌等特殊功能，然而，殼聚糖只能溶于酸性溶液的性能缺陷使其在這一領(lǐng)域的應(yīng)用受到了極大限制

16、。因此，對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)改性，在殼聚糖分子上接入某些特殊基團(tuán)改變其水溶性，可以極大擴(kuò)展殼聚糖的應(yīng)用范圍。在更為理想的納米載藥粒子制備的設(shè)計(jì)中，尋求殼聚糖的水溶性途徑已成為能否將其成功用作納米載藥粒子基質(zhì)物質(zhì)的關(guān)鍵。本發(fā)明制備的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒具有獨(dú)特的優(yōu)勢，不僅具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且還由于N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖和N,O-羧甲基殼聚糖均具有很好的水溶性，帶正電性等特點(diǎn)，使得N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒的應(yīng)用范圍得到了極大的擴(kuò)展。 發(fā)明內(nèi)容1、本發(fā)明的目的是提供一種利用兩種電荷相反的殼聚糖衍生

17、物直接發(fā)生聚合來制備納米粒的方法，并利用該納米粒負(fù)載病毒的納米疫苗制備方法。2、本發(fā)明的技術(shù)方案是把2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（ETA）連接到殼聚糖（CS）的氨基上，形成N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（N-2-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride chitosan，N-2-HACC）；之后，再將N-2-HACC與N,O-羧甲基殼聚糖（N,O-carboxymethyl chitosan，N,O-CMC）聚合形成N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒（N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。該發(fā)明采取新城疫病毒（L系）作為

18、模型藥物。3、本發(fā)明包括以下步驟：（1）N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的合成1）殼聚糖的脫乙?；幚韺⒁阴６?5%的殼聚糖（11g）分散在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的（120ml 水30g NaOH）NaOH aq中，100下攪拌反應(yīng)5h，靜置，傾出上層清液，去離子水洗至中性（PH=7），抽濾，干燥。2）殼聚糖的浸泡處理將脫乙酰處理的6g殼聚糖溶于240ml 10%的乙酸 aq中，緩慢攪拌溶解數(shù)小時(shí)，逐漸滴入NaOH aq，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液PH=9，有白色沉淀析出，浸泡8h，抽濾，去離子水洗至濾液呈中性，抽干水分，烘干。3）殼聚糖與環(huán)氧丙基二甲基二乙基氯化銨的開環(huán)反應(yīng)將上述浸泡處理后的殼聚糖倒入三口燒瓶

19、中，加入60ml異丙醇，攪拌分散均勻后呈漿狀。三口燒瓶升溫至60，加入9g/50ml環(huán)氧丙基二甲基二乙基氯化銨異丙醇aq，30min內(nèi)逐漸滴完，反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后aq變澄清，燒杯底部有淺黃色粘稠物，冷卻至室溫。靜置，分層，加入冷藏處理的無水乙醇300ml沉淀，粘稠物顏色變淺，浸泡0.5h，抽濾，65真空干燥。4）N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖的精致將干燥后的N-2-羥丙基二甲基乙基氯化銨殼聚糖溶于水，3G紗芯漏斗過濾，濾液在5倍體積丙酮中沉淀得到淡黃色沉淀物。在步驟（1）1）中，殼聚糖脫乙酰采用間歇法或連續(xù)法，用NaOH異丁醇溶液處理。NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%-40%，異丁醇的量為每

20、克殼聚糖加入10-30mL，處理溫度為90-120，處理時(shí)間為1.5-8h。在步驟（1）2）中，乙酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為1%-3%，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH的NaOH溶液濃度為0.1mol/L-2.0mol/L。在步驟（1）3）中，2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨ETA與殼聚糖的質(zhì)量比為11-91，反應(yīng)溫度為75-85，反應(yīng)時(shí)間為8-14h。本發(fā)明所使用的殼聚糖來源豐富，季銨化原料ETA已有工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，適宜大規(guī)模生產(chǎn)。使用本方法合成的N-2-HACC取代度高，最高可達(dá)100%，水溶性良好。本發(fā)明所使用的殼聚糖來源豐富，季銨化原料2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨已有工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本較低，適宜大規(guī)模

21、生產(chǎn)。使用本方法合成的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖取代度較高，最高可達(dá)100%，水溶性良好。本發(fā)明采用的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的取代度為50%-75%。（3）N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖新城疫減毒活疫苗納米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）的制備1）取1mg/mL N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液5mL，向其中緩慢滴加入2mL新城疫L-系病毒液（病毒含量為108.5EID50），磁力攪拌3min混合均勻；2）在室溫、無菌條件下，1200r/min磁力攪拌30min后，向其中勻速緩慢滴加入1mg/mLN,O-羧甲基殼聚糖溶液2mL；

22、3）將該溶液于4、12000r/min離心2min，沉淀經(jīng)去離子水洗三次，真空冷凍干燥24h，即得負(fù)載新城疫減毒活疫苗N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。在步驟（3）1）中，N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液的濃度可為0.5-20mg/mL，步驟（3）2）中N,O-羧甲基殼聚糖的濃度為0.5-3.0mg/mL，投藥量為1.25-7.5mL，攪拌速度為900-1300r/min，攪拌時(shí)間為10-40min。與殼聚糖納米粒子相比，本發(fā)明制備的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs粒徑容易控制，NDV-N-2-

23、HACC/N,O-CMC-NPs粒徑為120-500nm之間，NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs Zeta電位在38mV左右，最大包封率可達(dá)98%。具體實(shí)施方式1、N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的合成（1）殼聚糖的脫乙酰化處理將50g脫乙酰度為80%的殼聚糖分散在200mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%NaOH異丁醇溶液中，110回流攪拌反應(yīng)1h，冷卻，靜置，傾去上清液，真空抽濾，去離子水洗至濾液呈中性；之后，再將上步處理的殼聚糖分散在200mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% NaOH異丁醇溶液中，繼續(xù)回流攪拌反應(yīng)1.5h，冷卻，靜置，傾去上清液，真空抽濾，去離子水洗至中性。 （2）殼聚糖的浸泡處理將3g

24、脫乙酰處理的殼聚糖溶于150mL體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸溶液中，攪拌溶解，真空抽濾，濾去不溶物。500-1000r/min條件下逐滴加入0.1mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)殼聚糖溶液pH=9，逐漸有白色沉淀析出，浸泡8h，抽濾，去離子水洗至濾液呈中性，抽干水分。濾餅中加入30mL異丙醇，攪拌30min分散均勻，倒入三口燒瓶。（3）殼聚糖與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨開環(huán)反應(yīng)在N2保護(hù)條件下，將三口燒瓶升溫至80，每隔2h逐滴加入定量的2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨的異丙醇溶液，分三次加完，每次滴定時(shí)間控制在30min，反應(yīng)12h后將三口燒瓶冷卻至室溫，加入300mL冷藏處理的無水乙醇，浸泡0.5h，

25、抽濾，冷凍干燥24h。（4）N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的精制將干燥后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶于去離子水，3G砂芯漏斗過濾，濾液在5倍體積的冷藏處理的丙酮中沉淀；真空抽濾，濾餅分散后冷凍干燥24h；分裝，充入N2密封室溫保存。圖6為此條件下合成的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的取代度測定，取代度為34%。圖7為此條件下合成的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖和殼聚糖溶液的透光率對pH的依賴關(guān)系。2、N,O-羧甲基殼聚糖的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為：1）溶脹 準(zhǔn)確稱取5g干燥的殼聚糖粉末置于三口燒瓶中，加入40mL異丙醇，攪拌，使其常溫溶脹2h。2）堿化 向反應(yīng)器中加

26、入60mL10mol/L NaOH溶液，攪拌均勻后浸泡12h，得堿化殼聚糖，讓殼聚糖在堿性條件下膨脹，形成堿化中心。3）羧甲基化 將20g氯乙酸水浴加熱充分溶于10mL的異丙醇中，分五次加入溶液中，每次間隔10min，60、反應(yīng)8h，得羧甲基殼聚糖混合物。4）精制 反應(yīng)結(jié)束后，向溶液中加入20mL蒸餾水，1%鹽酸調(diào)pH至7.0；布氏漏斗抽濾，濾液中加入4倍量的無水乙醇充分沉淀，過濾，分別用95%乙醇、無水乙醇洗滌。所得產(chǎn)品放入真空干燥箱內(nèi)干燥，即得白色粉狀N,O-CMC。圖11為此條件下合成的N,O-羧甲基殼聚糖的取代度測定，取代度為60%。圖12為此條件下合成的N,O-羧甲基殼聚糖和殼聚糖溶液的透光率對pH的依賴關(guān)系。（3）N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒子的制備：1）取1mg/mL N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液5mL，向其中緩慢滴加入2mL新城疫L-系病毒液（病毒含量為108.5EID50），磁力攪拌3min混合均勻；2）在室溫、無菌條件下，1200r/min磁力攪拌30min后，向其中勻速緩慢滴加入1mg/mLN,O-羧甲基殼聚糖溶液2mL；3）將該溶液于4、12000r/min離心2min，沉淀經(jīng)去離子水洗三次，真空冷凍干燥24h，即得負(fù)載新城疫減毒活疫苗N-2-羥丙基三甲基氯化