RNA提取相關(guān)試劑——DEPC和TRIS

1、DEPC焦碳酸二乙酯（DEP。: DEPC即 diethypyrocarbonate ,DEPC結(jié)構(gòu)式中文名為。分子式為 C6H10O5,分子量為162.14。是一種強(qiáng)烈但不徹底的 RNA酶抑制劑。 它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪哩環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。DEPC可以抑制植物細(xì)胞上的 NSCC即nonselective cation channel （非選擇性陽(yáng)離子通道）。是常 用的NSCCW制劑.DEPC# 性1. DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）是一種高效烷化劑。配置：加 0.1% DEPC 到去離子水中，混勻過(guò)夜，然后高溫高壓121 C

2、, 20min, DEPC即降解成二氧化碳和水無(wú)毒。 2. DEPC有刺激性，對(duì)眼睛氣道粘膜有強(qiáng)刺激，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下 進(jìn)行，DEPC毒性并不是很強(qiáng)，但吸入的毒性是最強(qiáng)的，使用時(shí)戴口罩，不小心占到手上注 意立即沖洗。3. DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì)，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯類(lèi)衍生物，其中尿烷是一種已知的致癌物質(zhì)。DEPC水泡過(guò)一次槍頭后還能再用嗎 ？是否每次都要重配？ 答：不能再用。每次處理耗材時(shí)都要用新配的。 DEPC水用于配制電泳緩沖液和溶解RNA.DEPC在水中的半衰期25C、磷酸緩沖液中其半衰期為 4 min （pH 6）、9 min （pH 7）。Tris緩沖液中

3、DEPC的降 解會(huì)加快，25C時(shí)，半衰期為 1.25 min （pH 7.5）、0.37 min （pH 8.2）。DEPC加入到水中之后并不會(huì)立即溶解， 而是形成小的球狀液滴（類(lèi)似于油滴），需要徹 底攪拌直至液滴消失才算混合均勻。此時(shí)的溶液才可以拿去高溫除菌除DEPG 一般滅菌15min即可將DEPC徹底除去。（試驗(yàn)所用試劑也可用 DEPC處理，加入 DEPC至0.1%濃度， 然后劇烈振蕩10分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的 DEPG否則DEPC也能和 腺喋吟作用而破壞 mRNA活性）配制泡實(shí)驗(yàn)器具的 DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC放在1000ml容量瓶中靜

4、 置4小時(shí)后備用。（DEPC在高壓時(shí)分解為二氧化碳和乙醇，所以，用來(lái)處理實(shí)驗(yàn)器具的 DEPC水，就不能高壓）配75%乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝 40ml雙蒸水，加 40ulDEPC 37 C過(guò) 夜，送至高壓。（用來(lái)配制試劑的 DEPC水是可以高壓的。）用途DEPC是一種有效的核酸酶抑制劑，它能夠與很多酶的-NH, -SH或-OH等基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而破壞酶的活性位點(diǎn)。一般，常用濃度為 0.1% （1 L水中加入1 mL DEPC的DEPC來(lái)作為 RNA酶的抑制劑。比如，進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)，要用DEPC處理實(shí)驗(yàn)所用的水和各種溶液。我們通常所說(shuō)的 DEPC（處理）水是指用 DEPC處

5、理過(guò)并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。DEPC（處理）水可以用于 RNA沉淀的溶解，含有 RNA的各種反應(yīng)體系如反轉(zhuǎn)錄、siRNA的退火等，以及其它各種要求無(wú)RNas& DNase和proteinase的反應(yīng)體系。使用注意事項(xiàng)1、DEPC可能溶解掉某些塑料槍頭，因此，量取DEPC時(shí)要用玻璃器具。2、DEPC處理后的溶液要去除殘余的DEPC 一般121 C滅菌15 min即可，也可以將其煮沸 15 min以達(dá)到去除的效果?？赡軙?huì)殘留些許氣味，可以放心使用。3、因?yàn)镈EPC在Tris、HEPES等緩沖液中極易分解，因此不能直接用DEPC來(lái)處理Tris、HEPES緩沖液。這種情況下，要先用D

6、EPC處理水，然后再用 DEPC處理過(guò)的水來(lái)配制緩沖液。TRIS性質(zhì)描述：白色結(jié)晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯、不溶于乙酰、四氯 化碳，對(duì)銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性。緩沖特性Tris為弱堿，在25C下，它的pKa為8.1;根據(jù)緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖 范圍在pH7.0到9.2之間。Tris堿的水溶液pH在10.5左右，一般加入鹽酸以調(diào)節(jié) pH值至所 需值，即可獲得該 pH值的緩沖液。但同時(shí)應(yīng)注意溫度對(duì)于Tris的pKa的影響。衍生緩沖液由于Tris緩沖液為弱堿性溶液，DNA在這樣的溶液中會(huì)被去質(zhì)子化，從而提高其溶解性。人們常常在 Tris鹽酸緩沖液中加入 EDTA制成“

7、TE緩沖液”，TE緩沖液被用于DNA的 穩(wěn)定和儲(chǔ)存。如果將調(diào)節(jié)pH值的酸溶液換成乙酸，貝U獲得“TAE緩沖液”(Tris/Acetate/EDTA), 而換成硼酸則獲得“ TBE緩沖液”(Tris/Borate/EDTA)。這兩種緩沖液通常用于核酸電泳實(shí)驗(yàn) 中。制備Tris可以由兩步反應(yīng)生成：先由硝基甲烷生成中間體三羥甲基硝基甲烷 (HOCH2)3CNO2)，然后再由該中間體還原得到Tris=應(yīng)用Tris常用作生物緩沖液，常配成pH值為6.8, 7.4, 8.0, 8.8。其pH值隨溫度變化很大。一般來(lái)說(shuō)，溫度每升高一度，PH值下降0.03。1M Tris-HCl 6.8 和 1.5M Tri

8、s-HCl 8.8 是 SDS-PAGEt常用的試劑。而由Tris配成的TAE TBE等是DNA電泳最常用的試劑，TE( pH8.0)主要用于溶解 DNA。 (TE 為 Tris 加 EDTA 合稱(chēng)。)Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，還有許多重要用途。Tris被用于不同pH條件下的蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)。Tris緩沖液的低離子強(qiáng)度特點(diǎn)可用于線蟲(chóng)( C. elegans)核纖層蛋白(lamin)的中間纖維的形成。Tris也是蛋白質(zhì)電泳緩沖液的主要成分之一。此外，Tris還是制備表面活性劑、硫化促進(jìn)劑和一些藥物的中間物。Tris也被用作滴定標(biāo)準(zhǔn)物。TRIzol主要成分TRIzol的主要成分

9、是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此 TRIzol中還加入了 8 羥基喳帳異硫割酸月瓜、份疏基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase （RNA酶）。湘.1%的8羥基喳咻可以抑制 RNase與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。浙硫割酸月瓜屬于解偶劑，是一類(lèi)強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑， 可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失， 導(dǎo)致細(xì) 胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。&疏基乙醇的主要作用是破壞 RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。使用方法用勻漿器將組織磨碎，加入TRIzol處理組織。5分鐘后加入氯仿，以每分鐘12000轉(zhuǎn)離心5

10、分鐘，樣品即分成水樣層、中間層和有機(jī)層。湛NA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過(guò)異丙醇沉淀RNA來(lái)還原。他除去水樣層后，有機(jī)層中的DNA和蛋白質(zhì)也能相繼以沉淀的方式還原：乙醇能使中間層的DNA沉淀析出，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白質(zhì)。每100ml TRIzol可以抽提100個(gè)六孔板中的樣品或 100個(gè)50-80mg的組織樣品。無(wú)論樣 品是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，該方法對(duì)少量的組織（50-100mg）和細(xì)胞（約五百萬(wàn)個(gè)）及大量的組織（A 1卵細(xì)胞（超過(guò)一千萬(wàn)個(gè)）均有較好的分離效果。每一百萬(wàn)細(xì)胞用 TRIzol抽提可得5-15微克RNA,每毫克組織用 TRIzol抽提可得1-10微 克R

11、NA （產(chǎn)量因細(xì)胞和組織不同而異）。TRIzol操作上的簡(jiǎn)便性允許其同時(shí)處理多個(gè)樣品，所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIzol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白質(zhì)的污染，故而能夠作RNA印跡分析、斑點(diǎn)雜交、 poly（A）+選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和單分子克?。?PCR。汝口果是用于PCR當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí)，建議用級(jí)聯(lián)擴(kuò)大的 DNase I（Cat. No.18068）來(lái)處理抽提的總 RNA。MRIzol試劑能促進(jìn)不同種屬、不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳并用漠化乙嚏染色，可見(jiàn)許多介于7kb和15kb之間的不連續(xù)的高分子量條帶

12、（mRNA和hnRNA成分），兩條優(yōu)勢(shì)核糖體 RNA條帶位于5 kb （28S刖2 kb （18S）,低分子量 RNA介于0.1和0.3kb之間（tRNA, 5S*當(dāng)抽提的 RNA用TE稀釋時(shí)，其 A260/A280比值 1.8抽提小 RNA時(shí)宜-70頃淀過(guò)夜。TRIzol對(duì)人體有害，使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套，注意防止濺出。1. 樣品的制備 當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉，脂肪組織和植物的塊莖部分時(shí)可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在28°C的條件下以12,000 X g的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量 DN

13、A，而上層的超浮游物含有 RNA。在來(lái)自于脂肪組織的樣品中，大量的脂肪 漂在最上層因而應(yīng)該除掉。 在每一個(gè)個(gè)案中，將清亮的勻漿溶液轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中加入 氯仿并繼續(xù)進(jìn)行下述的分離步驟。2. 分離階段 將勻漿樣品在1530 C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。 每1 mlTRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在30 °C下孵育23分鐘。在28°C下以不超過(guò)12,000 Xg的離心力高速冷凍離心 15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TR

14、IZOL容量的60%。3. RNA的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機(jī)層同樣要予以保留。通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA。最初均化時(shí)的每 1 ml TRIZOLM應(yīng)0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15-30C條件下孵育10分鐘并在28°C下以不超過(guò)12,000 Xg 的離心力高速冷凍離心 10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，形成一膠狀片狀沉淀附著 于試管壁和管底。4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用 75%的乙醇洗滌 RNA沉淀一次，每1 ml的TRIZOL 少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在28°C下以不超過(guò)7,500

15、 X豹離心力高速冷凍離心5分鐘。5. RNA的再溶解 在操作的最后，簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀（空氣干燥或真空干燥 5-10分鐘） 不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無(wú) RNA酶的水或0.5% SDS溶液來(lái)溶解 RNA,并在55-60° C下孵育10分鐘（當(dāng)RNA以后要用于酶 切反應(yīng)時(shí)，避免使用 SDS） RNA還能被100%甲酰胺（除去離子）再溶解并保存在成0°RNA抽提注意事項(xiàng)1. 從少量的組織（1-10 mg）或細(xì)胞（102-104）中分離 RNA樣品：往組織或細(xì)胞中加入800&micro;l TRIZOL。待樣品裂解后，加入氯仿并進(jìn)行步驟 2中的抽提操作。在用異丙醇沉淀 RNA 之前，加入5-10八無(wú)RNA酶的脂質(zhì)體（CatNo 10814）作為水樣層的載體。為降低其黏度在 加入氯仿