Id1啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建及其在肝癌HepG2細(xì)胞中的活性檢測1

1、Id1啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建及其在肝癌HepG2細(xì)胞中的活性檢測(1) 丁睿，韓霜，雷婷，劉杰，竇科峰 【摘要】 目的：擴(kuò)增Id1啟動(dòng)子基因，構(gòu)建Id1啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體. 方法：通過PCR及雙酶切方法，從HepG2細(xì)胞基因組DNA中獲得Id1基因編碼序列上游包含不同長度堿基的兩段Id1啟動(dòng)子序列；分別克隆到報(bào)告基因pGL3 enhancer載體上，構(gòu)建包含兩段不同長度Id1啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將兩報(bào)告基因載體分別轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細(xì)胞系；采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)評估Id1啟動(dòng)子活性. 結(jié)果：經(jīng)PCR方法擴(kuò)增出大小分別為1096 bp和266 bp的兩段不同長

2、度的Id1啟動(dòng)子片段，序列測定其編碼序列及讀框正確，酶切鑒定亞克隆序列正確. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2后經(jīng)報(bào)告基因檢測，兩段啟動(dòng)子均具有轉(zhuǎn)錄活性. 結(jié)論：成功構(gòu)建了Id1啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體，為進(jìn)一步研究Id1啟動(dòng)子和肝癌的關(guān)系奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 分化抑制因子 0引言 Id蛋白即分化抑制或DNA結(jié)合抑制蛋白是缺少DNA結(jié)合HLH轉(zhuǎn)錄因子的顯性負(fù)性 調(diào)節(jié)分子. 已知哺乳動(dòng)物Id蛋白家族有Id1Id4等4位成 員. 它們可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞生長、衰老、分化、凋亡和血管生成等1. 研究2表明Id蛋白特別是Id1，可通過滅活腫瘤抑制因子和激活生長促進(jìn)通路而促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的

3、進(jìn)行，其可能是腫瘤增殖所必需的關(guān)鍵因子. Id1可能是預(yù)測慢性肝炎肝硬化患者的肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的有用指標(biāo)， 并且可作為治療肝癌的靶向分子. 我們擬構(gòu)建兩段包含不同長度Id1啟動(dòng)子片段的報(bào)告基因載體， 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后檢測兩段Id1啟動(dòng)子的活性. 1材料和方法 材料pGL3enhancer 載體，內(nèi)參照pRLTK載體和 luciferase reporter Kit；DualLipofectaminTM Reagent 和T4 DNA連接酶；細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒；高保真Taq DNA聚合酶；Plasmid Miniprep Kit和Gel Extration Kit；DNA marker:

4、 GeneRulerTM 100 bp DNA ladder Plus和GeneRulerTM 1 Kb DNA ladder； 胰蛋白胨及酵母提取物； 限制性內(nèi)切酶Hind，Kpn； 其余試劑均為國產(chǎn)分析純. TD20/20熒光照度計(jì)； HepG2細(xì)胞和 JM109菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存. 方法 啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建 引物設(shè)計(jì)自XX網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫檢索獲得Id1啟動(dòng)子序列的-3000 100部分序列，分別設(shè)計(jì)兩段啟動(dòng)子引物序列，并 在上游引物5端加入Kpn的酶切位點(diǎn)GGTACC，在下游引物5端加入Hind的酶切位點(diǎn)AAGCTT. 從轉(zhuǎn)錄起始零點(diǎn)開始， 兩段啟動(dòng)子片段長度分別為:101976和18

5、976. 上游引物分別為Fw1：gggtaccgggagcacgggaactagc和Fw2：gggtaccccacccttgctgttctga；下游引物 Rv：aagcttggagaatgggcaaagcgaaa. 細(xì)胞培養(yǎng)及模板提取將HepG2細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37，50 mL/L CO2的孵箱中培養(yǎng). 收集對數(shù)生長期細(xì)胞約1×107，以細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA. 啟動(dòng)子基因的克隆以HepG2細(xì)胞基因組DNA為模板，用Fw1為上游引物、Rv為下游引物，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇94變性1 min，55退火1 min，72延伸1 min,

6、 共30個(gè)循環(huán)，獲得一長度為1096 bp的片段，命名為Id1p1；選用Fw2為上游引物、Rv為下游引物，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇94變性30 s，54退火30 s，72延伸45 s, 共30個(gè)循環(huán)，獲得一長度為266 bp的片段，命名為Id1p2. 用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳獲得2條鑒定條帶，大小分別約為1100 bp和260 bp. 參照試劑盒的操作說明回收并純化. 啟動(dòng)子載體的構(gòu)建與測序?qū)晒馑孛笀?bào)告基因pGL3 enhancer載體分別行Kpn和Hind雙酶切，回收. 同時(shí)將之前回收的PCR產(chǎn)物同樣經(jīng)Kpn和Hind雙酶切及瓊脂糖 凝膠電泳，分別回收約1100 bp和260 bp條帶. 使之

7、分別在T4連接酶的作下與pGL3enhancer載體以31和10 1的濃度比于16連接12 h，使Id1p1和Id1p2基因序列插入無啟動(dòng)子的pGL3enhancer載體中. 以低溫CaCl2法轉(zhuǎn) 化感受態(tài)細(xì)菌，涂布于含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)皿上，12 h后挑取單克隆菌落，以質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒. 行Kpn和Hind雙酶切并測序鑒定陽性克隆的重組質(zhì)粒. 最終構(gòu)建成重組報(bào)告基因載體Id1p1/PGL3和Id1p2/PGL3. 啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系將兩種重組質(zhì)粒、空載體pGL3enhancer和內(nèi)參照pRLTK載體轉(zhuǎn)化的陽性 菌株，在LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜，按質(zhì)粒提取說

8、明分別提取Id1p1/pGL3，Id1p2/pGL3、空載體pGL3enhancer TK的DNA，經(jīng)紫外分光光度儀測定A260 nm值. pRL和按 照LipofectaminTM Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)說明，于轉(zhuǎn)染前1日將細(xì)胞接種于24空板，5×104/孔，第2日當(dāng)細(xì)胞約90%融合時(shí)，每孔分別定量加入Id1p1/pGL3 g，PRLTK 內(nèi)參照載體100 ng，LipofectaminTM 5 L和無血清培養(yǎng)基200 L. 6 h后換含F(xiàn)BS 100 mL/L的RPMI 1640，培養(yǎng)18 h. 報(bào)告基因活性的檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后收集、裂解細(xì)胞，離心取上清，用Dual L

9、uciferase Reporter Assay System 在TD20/20熒光照度計(jì)上測定裂解上清內(nèi)Luc 活性, 計(jì)算 Firefly Luc / Renilla Luc的比值，并以空載體pGL3 enhancer轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對照，進(jìn)行比較以判斷Id1p1和Id1p2 啟動(dòng)子活性. 2結(jié)果 目的基因的克隆及測序以肝癌細(xì)胞HepG2基因組DNA為模板，分別克隆出兩段Id1啟動(dòng)子，分別為1096 bp的Id1p1和266 bp的Id1p2. 圖1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 略 啟動(dòng)子報(bào)告基因載體酶切及測序鑒定回收經(jīng)Kpn和Hind雙酶切得到的Id1p1和Id1p2兩重組質(zhì)粒和pGL3 enha

10、ncer載體的相應(yīng)條帶，經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌. 再經(jīng)Kpn和Hind酶切后，兩種重組質(zhì)粒分別釋放出1096 bp和266 bp大小的片段. 測序結(jié)果亦證實(shí)兩段均包含Id1啟動(dòng)子序列. 表明包含不同長短的Id1啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建成功. 圖2雙酶切重組質(zhì)粒瓊脂糖電泳 略 轉(zhuǎn)錄活性的檢測兩段Luc報(bào)道基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞均表現(xiàn)有Id1啟動(dòng)子活性，空載體pGL3enhancer對照為，Id1p1 為，Id1p2為，二啟動(dòng)子活性分別較對照升高倍和倍. 對結(jié)果分析表明，兩段均包含核心啟動(dòng)子部分. 而Id1p1顯示更高的啟動(dòng)子活性. 3討論 HLH轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化的重要作用，大多數(shù)H

11、LH蛋白屬于堿性的bHLH家族，具有高度保守的HLH結(jié)構(gòu)域和堿性DNA結(jié)合區(qū). Id蛋白是堿性DNA結(jié)合區(qū)缺失的bHLH蛋白，它與bHLH形成異源二聚體后即喪失結(jié)合DNA的能力，從而抑制了下游含有Ebox DNA片段的基因的轉(zhuǎn)錄， 因而在功能上Id是這類轉(zhuǎn)錄因子的顯性負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白. 能與Id蛋白結(jié)合的分子可以分為兩大類，包括組織普遍表達(dá)的E47和組織特異性表達(dá)的MyoD. Id與后一類分子結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于前者，但目前發(fā)現(xiàn)的這類分子屈指可數(shù). 研究表明，轉(zhuǎn)染外源性Id1的鼻咽癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的增殖率和S期細(xì)胞所占比例升高3. 異常表達(dá)Id1的前列腺癌細(xì)胞中p16INK4a水平降低

12、，CDK和磷酸化RB蛋白水平升高，提示Id1可能通過p16INK4a/pRB途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖4. 另一實(shí)驗(yàn)則表明Id1也可能通過激活MAPK途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖5. Id1的異常過表達(dá)還可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞持續(xù)增殖，當(dāng)下調(diào)Id1表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞周期素cyclinD1和cyclinE的表達(dá)下降和cyclinE Cdk2活性降低，以及pRB的Ser780位點(diǎn)的磷酸化程度降低，這與下調(diào)cmyc蛋白表達(dá)的作用效果類似，提示Id1也可 myc蛋白表達(dá)依賴途徑從而促進(jìn)細(xì)胞能參與cyclinD對c 周期進(jìn)程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖6. 而當(dāng)阻斷Id1，Id2和 Id3蛋白表達(dá)時(shí)，人結(jié)腸腺癌S期細(xì)胞比率降低，且與阻

13、斷量負(fù)相關(guān)7. 此外，研究發(fā)現(xiàn)，Id1和Id2在高度侵襲性前列腺癌細(xì)胞PC3中高表達(dá)，而在非侵襲性的LNCaP細(xì)胞中低表達(dá)，且阻斷Id2表達(dá)后，可使腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖能力降低8. 在上皮性卵巢腫瘤中，Id1的表達(dá)程度與腫瘤低分化和高侵襲特性相關(guān)，高表達(dá)的Id1可提示不良預(yù)后相關(guān)9. 以上均提示Id蛋白與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān). 目前Id蛋白與肝癌相關(guān)性的研究仍鮮有報(bào)道. 初步發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的Id1可能是預(yù)測慢性肝炎肝硬化患者的肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有價(jià)值的指標(biāo)10. 通過組織微陣列研究表明Id1的表達(dá)與VEGF表達(dá)顯著相關(guān)，它可通過穩(wěn)定化處理HIF1 alpha蛋白而介導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性. 下調(diào)VEGF可抑制Id1從而延緩腫瘤細(xì)胞侵襲11. 我們成功構(gòu)建了Id1兩段不同長度的啟動(dòng)子載體并順利轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系，使受控于Id1啟動(dòng)子的Luc報(bào)道基因在HepG2細(xì)胞中得到瞬時(shí)表達(dá).