基因克隆的一般流程ppt課件

1、基因克隆的普通流程基因的獲得基因的獲得PCRRT-PCR載體載體銜接銜接預備感受態(tài)細胞預備感受態(tài)細胞轉化轉化重組子挑選重組子挑選下游任務下游任務載體的選擇n基因工程載體普通要求：基因工程載體普通要求：n能在宿主細胞中復制繁衍，有較高的自主復制才干。能在宿主細胞中復制繁衍，有較高的自主復制才干。n易進入宿主細胞，進入效率越高越好。易進入宿主細胞，進入效率越高越好。n適宜的多克隆位點適宜的多克隆位點MCS可接受外源片段，且不影響其可接受外源片段，且不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復制。進入宿主細胞和在細胞中的復制。n易從宿主細胞中分別純化出來，易從宿主細胞中分別純化出來， 便于重組操作。便于重組操

2、作。n有挑選標志，當其進入宿主細胞、或攜帶著外源序列進入有挑選標志，當其進入宿主細胞、或攜帶著外源序列進入宿主細胞都能容易被識別和分別出來。便于克隆操作。宿主細胞都能容易被識別和分別出來。便于克隆操作。n常用的載體有質粒、噬菌體和病毒等常用的載體有質粒、噬菌體和病毒等重組 DNA 技術的普通流程 目的目的DNADNA的獲得的獲得 目的目的DNADNA與載體的銜接與載體的銜接 重組子導入受體細胞重組子導入受體細胞 重組子的挑選和鑒定重組子的挑選和鑒定實驗一:pEGFP-NGF質粒載體的構建nNGF 基因的克隆(T-A克隆)NGF-sense: a GAGCTC aagatgctgtgcctcaa

3、gccagtNGF-antisense: at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg5 56 6pEGFP 熒光質粒表達載體質粒DNA的酶切反響結果質粒質粒 M M 酶切反響酶切反響 M M 酶切反響酶切反響pEGFP pT-NGF酶切產物凝膠回收操作步驟Gel Extraction Kit認逼真下含DNA的凝膠，置一稱重的1.5ml離心管中。稱重。按300lS1溶液/100mg凝膠參與的比例參與S1溶液，置50水浴10分鐘，使凝膠完全溶化，每2分鐘顛倒混勻一次。將溶化后的凝膠溶液移入吸附柱，置搜集管中，9000g30秒，倒掉搜集管中的液體，再將吸附柱放入同一搜集管中。在吸

4、附柱中參與500l W1溶液，9000g15秒，倒掉搜集管中的液體，再將吸附柱放入同一搜集管中。反復一次洗柱。將吸附柱放入同一搜集管中。9000g1分鐘。將吸附柱放入一新1.5ml離心管中，在吸附膜中央參與30lddH2O，靜置1分鐘，9000g1分鐘。備用。重組子的挑選n耐藥性基因 n 外源質粒賦予宿主抗生素抗性n藍白斑挑選互補景象 n lacZ plasmid 和 M15 cell strain 關于銜接酶定義：定義：ATP存在下，在存在下，在3OH和和5 P之間構成磷酸二酯鍵。之間構成磷酸二酯鍵。特性：銜接粘端的效率遠高于平端。特性：銜接粘端的效率遠高于平端。戰(zhàn)略：戰(zhàn)略：o首選不匹配粘端

5、首選不匹配粘端o次選匹配粘端，載體脫磷次選匹配粘端，載體脫磷o平端銜接，延伸時間，提高酶量平端銜接，延伸時間，提高酶量平端銜接圖示匹配粘端銜接圖示 不匹配粘端銜接圖示銜接反響的建立 銜接反響的溫度：銜接反響的溫度： 粘性末端，按粘性末端，按A-T，G-C含量計算，含量計算，5。 如如 Pst ICTGCAG，12 ，EcoRIGAATTC，8。 平末端，如平末端，如EcoRGATATC，可在室溫進展，可在室溫進展，不超越不超越30，酶的用量要比粘性末端加大，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍倍 。 DNA量：量： 摩爾數之比摩爾數之比 載體載體:目的目的 DNA 1 : ( 13 ) 載體

6、摩爾數載體摩爾數 目的基因片段堿基數目的基因片段堿基數載體載體分量分量 目的目的DNA摩爾數摩爾數 目的基因片段分量目的基因片段分量載體載體堿基數堿基數 載體和目的基因的銜接反響 如未定量可以按回收效率75計算DNA濃度，按載體與目的基因摩爾數比1:3進展銜接。 銜接反響在滅菌的0.5ml離心管中進展。15 l體積反響體系中： 加ddH2O使終體積為 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15- 30 ng 10Ligase Buffer (已含有ATP) 1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l 悄然混勻，稍加離心, 14-16或4,O/N 。重組子轉入受體細胞 體外重組的體外重組的DNADNA引入受體細胞引入受體細胞 感受態(tài)感受態(tài): :受體細胞處于易于接受外源受體細胞處于易于接受外源 DNA DNA 的形狀的形狀 原理原理: :1 1遺傳物質的傳送遺傳物質的傳送 2 2受體菌的選擇與改造受體菌的選擇與改造重組質粒的酶切鑒定重組子的鑒定n插入片段長度大小鑒定插入片段長度大小鑒