sop微生物檢查操作規(guī)程

1、 頒發(fā)部門 微生物限度檢查操作規(guī)程接收部門生效日期操作標(biāo)準(zhǔn)-質(zhì)量制定人制定日期文件編號(hào) 審核人審核日期文件頁(yè)數(shù)共6頁(yè)批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期分發(fā)部門 1目的 建立微生物限度檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2 范圍 適用于本廠質(zhì)監(jiān)科化驗(yàn)室對(duì)本廠生產(chǎn)的固體制劑及物料進(jìn)行微生物限度的檢查。3 責(zé)任 化驗(yàn)員有責(zé)任按照本操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)、判定,并對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果負(fù)責(zé)。4 定義 微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。5 內(nèi)容5.1 總則：5.1.1 供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量。5.1.2 供試品在檢查

2、前不得開(kāi)啟，檢查全過(guò)程均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，嚴(yán)防再污染。5.1.3 控制菌的污染檢查應(yīng)做相應(yīng)的已知菌對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)照菌株為大腸桿菌CMCC（B）44102，每批試驗(yàn)已知菌加入量為50-100個(gè)。5.1.4 染菌量的檢查或控制菌的檢查均應(yīng)做空白對(duì)照試驗(yàn)。5.1.5 供試品稀釋成稀釋液后應(yīng)在均勻狀態(tài)下取樣，凡有抑菌成份或防腐劑的供試品應(yīng)做特殊處理后進(jìn)行檢驗(yàn)。5.1.6 供試品稀釋后應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)操作完畢。 第2頁(yè)/共6頁(yè)5.1.7 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30-35，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25-28，控制菌培養(yǎng)溫度為36±1。5.1.8細(xì)菌、霉菌檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告以1g、1ml或10cm

3、2為單位；控制菌檢驗(yàn)報(bào)告以每1g、每1ml或每10cm2為單位報(bào)告“檢出”或“未檢出”。5.2儀器、用具 恒溫培養(yǎng)箱、隔水式生化培養(yǎng)箱、電子天平，移液管(1ml、10ml)、試管、離心管、雙碟、鑷子、剪刀、不銹鋼吸管筒、酒精燈、取樣勺、稱量紙、研缽一個(gè)、不銹鋼雙碟筒。5.2.1用具的包扎 移液管：用紗布包住移液管，然后放入不銹鋼滅菌筒內(nèi)。 試管、雙碟：試管在管口塞上紗布棉塞、雙碟放入不銹鋼雙碟筒內(nèi)。 無(wú)菌衣、褲、帽、口罩：用布口袋將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套后裝入，扎緊袋口，再用牛皮紙包好。5.2.2用具的滅菌 將包扎好的用具，在121±0.5 蒸汽滅菌柜中滅菌30 分鐘，物品取出時(shí)

4、切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內(nèi)蒸汽凝造成負(fù)壓，易致染菌，應(yīng)置烘箱烘干。5.3培養(yǎng)基、試劑5.3.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 稱取本品36克，加1升蒸餾水，加熱溶解后，按需要進(jìn)行分裝，經(jīng)12115分鐘滅菌備用。5.3.2虎紅培養(yǎng)基 稱本品30克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌11620分鐘。5.3.3膽鹽乳糖培養(yǎng)菌（BL） 稱本品36克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌11620分鐘。5.3.4曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB） 稱本品42克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌11620分鐘。5.3.5生理鹽水 稱取9 g 氯化鈉，加水1000 ml 溶解，分裝后于121±

5、0.5濕熱滅菌30分鐘，供作稀釋劑用。5.3.6 75%酒精棉 量取無(wú)水乙醇75ml，加水稀釋至100ml，搖勻，將脫脂棉與75%酒精混合即得。5.3.7 0.1%新潔而滅 第3頁(yè)/共6頁(yè) 量取5%新潔而滅20ml，加水稀釋至約1000ml，搖勻，即得。5.4進(jìn)入無(wú)菌室的操作要點(diǎn) 用肥皂水洗手，換消毒鞋，關(guān)閉緩沖間紫外燈，將用具物品搬入傳遞窗口內(nèi)，用紫外燈滅菌15分鐘，關(guān)閉第一層門，用1%新潔而滅洗滌雙手，用消毒毛巾擦干，換上無(wú)菌衣、褲、帽子、口罩及消毒鞋。關(guān)閉無(wú)菌室內(nèi)紫外燈，進(jìn)入第二層門并將用具搬至無(wú)菌室內(nèi)，關(guān)閉無(wú)菌室門。 凡進(jìn)入無(wú)菌室后不應(yīng)再外出取物品，因此，在每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好

6、，并準(zhǔn)備好備用物品。從進(jìn)入第一層門直至無(wú)菌室內(nèi)，隨工作人員的進(jìn)入就噴霧0.1%新潔而滅溶液。5.5檢查法：5.5.1 細(xì)菌、霉菌的染菌量，采用培養(yǎng)皿菌落計(jì)數(shù)法。5.5.1.1 供試液的制備： 固體供試品以無(wú)菌操作稱取10g，置含0.9%氯化鈉的生理鹽水100ml中，振搖溶解，使成1:10稀釋度的供試液。然后吸取1:10的供試液1ml，置含0.9%氯化鈉的生理鹽水9ml中，稀釋成1:100稀釋度的供試液。依次可制成1:1000的供試液。5.5.1.2 吸樣： 分別吸取1:10、1:100、1:1000的供試液1ml分別注入2-3個(gè)平皿中。5.5.1.3 注皿： 將事先融化并置45水浴中保溫備用的

7、細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)基分別傾注入平皿，每皿約15ml，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平面，使供試液與培養(yǎng)基混勻，分別作上標(biāo)記，置水平臺(tái)上待凝。同時(shí)作空白對(duì)照（不加樣品，將兩個(gè)雙碟分別加入虎紅培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，操作同上）。5.5.1.4 培養(yǎng)： 將凝固好的平皿按規(guī)定溫度倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)48小時(shí)；霉菌培養(yǎng)72小時(shí)。5.5.1.5菌落形態(tài) 細(xì)菌菌落是一個(gè)菌細(xì)胞或菌細(xì)胞團(tuán)在局限位置上，經(jīng)一定條件下繁殖成肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌群體，外觀濕潤(rùn)或干燥，表面光滑或折皺，外緣整齊或缺陷。 具有放射或樹(shù)枝樣分枝的菌絲是霉菌菌落的特征。初形成時(shí)多無(wú)色透明，有明顯的折光性，成熟的霉菌菌落有各種顏色的孢子形成。在較暗的背景下以透射光觀察

8、，易于識(shí)別。5.5.1.6菌落計(jì)數(shù)法： 先用肉眼觀察，標(biāo)記并計(jì)數(shù)，然后用5-10倍放大鏡檢查有無(wú)遺漏。 第4頁(yè)/共6頁(yè) 如有片狀菌落或花斑樣菌落蔓延生長(zhǎng)的以及平板受到污染的情況，則該平板計(jì)數(shù)無(wú)效。若平板上有2個(gè)或者2個(gè)以上的菌落重疊，如可分辯，仍以2個(gè)或是2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。當(dāng)一個(gè)稀釋級(jí)用2個(gè)平板時(shí)，應(yīng)采用2個(gè)平板菌落數(shù)的平均值。計(jì)算各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。 如各稀釋級(jí)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí)，則報(bào)告菌數(shù)為小于10個(gè)。 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則： 細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋級(jí)，霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30100之間的稀釋級(jí)作為報(bào)告菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。如

9、有1個(gè)稀釋級(jí)在30300（30100）之間時(shí)，將該稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)在30300（30100）之間時(shí)，按下式計(jì)算兩級(jí)比值。 高稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) 比值 = 低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) 當(dāng)比值2時(shí)，以兩稀釋級(jí)的均值報(bào)告，當(dāng)比值>2時(shí)，以低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如同時(shí)有3個(gè)稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均在30300之間時(shí)，以后2個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值報(bào)告；如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均不在30300以最接近30或300的稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍

10、數(shù)報(bào)告；如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均小于30時(shí)，一般按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。5.5.2 控制菌的檢查： 除另有規(guī)定外，取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭染色、生化試驗(yàn)與血清凝集試驗(yàn)等項(xiàng)檢查。5.5.2.1大腸桿菌檢查法： 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌50-100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18-24小時(shí)（必要時(shí)可延至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時(shí)

11、與24小時(shí)時(shí)，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽(yáng)性對(duì)照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性；無(wú)熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。 當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄 第5頁(yè)/共6頁(yè)明，并證明無(wú)菌生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。 如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18-24小時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。或有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑

12、選2-3個(gè)可疑菌落按照藥典規(guī)定作生化試驗(yàn)及革蘭染色、鏡檢，并按規(guī)定判斷結(jié)果。5.5.2.2大腸桿菌菌落形態(tài) 在EBM瓊脂平板上的典型菌落呈紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，帶有金屬光澤。 非典型形態(tài)，在EBM瓊脂平板上呈淺紫、粉紫、粉色，無(wú)明顯的暗色中心，應(yīng)做為疑似菌進(jìn)行鑒定。5.5.3對(duì)照試驗(yàn)：5.5.3.1陰性對(duì)照試驗(yàn)：檢驗(yàn)試驗(yàn)全過(guò)程無(wú)菌技術(shù)的可靠性。5.5.3.1.1 菌數(shù)測(cè)定陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別吸取生理鹽水1ml置于無(wú)菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌測(cè)定方法注皿、培養(yǎng)，不得長(zhǎng)菌。5.5.3.1.2 控制菌檢查陰性對(duì)照試驗(yàn) 吸取生理鹽水于增菌液中，按控制菌檢查方法檢查不得長(zhǎng)菌

13、。5.5.3.2 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：檢查供試品是否對(duì)控制菌生長(zhǎng)產(chǎn)生干擾作用及檢查培養(yǎng)條件是否適宜。5.5.3.2.1 方法：于供試液中加入一定量的相應(yīng)對(duì)照菌，做平行試驗(yàn)。5.5.3.2.2 規(guī)定陽(yáng)性對(duì)照菌株為大腸桿菌CMCC（B）44102。對(duì)照菌的加入量為50-100個(gè)，可事先預(yù)試確定。5.5.3.2.3 用計(jì)數(shù)方法，取37培養(yǎng)18-20小時(shí)的新鮮肉湯培養(yǎng)物，以10倍遞增稀釋至10-6,取其0.1ml于普通肉湯瓊脂板表面涂抹進(jìn)行測(cè)定。5.5.3.2.4 當(dāng)供試品未檢出菌時(shí)，而陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)也未能檢出，則不能做出供試品未檢出控制菌的結(jié)論。5.5.3.2.5 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)操作必須與供試品檢驗(yàn)操作嚴(yán)格分

14、開(kāi)，避免交叉污染。5.6復(fù)試：5.6.1 菌數(shù)測(cè)定不合格者應(yīng)復(fù)試，控制菌檢驗(yàn)以一次檢驗(yàn)為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試，但應(yīng)保留檢出菌株一個(gè)月備查。5.6.2 復(fù)試項(xiàng)目以不合格項(xiàng)目為準(zhǔn)，做單項(xiàng)復(fù)試。5.6.3 復(fù)試需取同批樣品測(cè)定2次。5.6.4 復(fù)試報(bào)告以3次測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值報(bào)告。 第6頁(yè)/共6頁(yè)5.7 檢驗(yàn)報(bào)告：5.7.1 測(cè)定菌數(shù)報(bào)告：以各次測(cè)定結(jié)果的全部平均值報(bào)告。5.7.2 控制菌以一次檢驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告：報(bào)告為檢出或未檢出控制菌。6 培訓(xùn)6.1 培訓(xùn)對(duì)象：化驗(yàn)員。6.2 培訓(xùn)時(shí)間：二小時(shí)。7 記錄 記錄名稱 保存部門 保存時(shí)間 微生物限度檢驗(yàn)記錄 質(zhì)監(jiān)科 藥品有效期后一年 QF-01-006-00微 生 物 限 度 檢 驗(yàn) 記 錄品 名： 批 號(hào)： 規(guī) 格： 檢驗(yàn)日期： 年 月 日細(xì)菌計(jì)數(shù) 3035 48h稀釋倍數(shù)空白1:101:100