分子生物學(xué)緒論8546999

1、第一章 緒 論一、分子生物學(xué)的基本含義分子生物學(xué)是一門從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué)。 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)作為分子生物學(xué)的重要分支，是從分子水平研究人體在正常和疾病狀態(tài)下的生命活動(dòng)及其規(guī)律，從分子水平開展人類疾病的預(yù)防、診斷和治療研究的一門學(xué)科。研究對象 生物大分子的結(jié)構(gòu)及在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用生物大分子：核酸 攜帶遺傳信息；蛋白質(zhì) 在遺傳信息傳遞，細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間通訊過程中發(fā)揮著重要作用學(xué)科地位 是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快的前沿領(lǐng)域與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域二、生命科學(xué)的發(fā)展歷史生命科學(xué)/分子生物學(xué) 主要包括三個(gè)不同層次的發(fā)展： 宏觀論證 問題研究 技

2、術(shù)手段宏觀論證這一研究層次的興趣點(diǎn)：只關(guān)心生命現(xiàn)象的最終結(jié)果。不研究生命現(xiàn)象的成因、過程、問題、機(jī)理問題研究（有人稱之為主題學(xué)科）這一研究層次的興趣點(diǎn)：對宏觀論證的證實(shí)： 研究生命現(xiàn)象中的各種問題和機(jī)理研究歷程: 分類學(xué) 胚胎學(xué) 生理學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)··· ··· 遺傳學(xué) 技術(shù)手段（有人稱之為方法學(xué)科）這一研究層次的興趣點(diǎn)：提供問題和機(jī)理研究的方法學(xué)。技術(shù)方法的領(lǐng)先，才有研究工作的深入和上臺(tái)階技術(shù)方法研究的發(fā)展歷程：形態(tài)解剖方法 細(xì)胞學(xué)方法 分子學(xué)方法三、分子生物學(xué)的研究和發(fā)展軌跡不斷把本學(xué)科的理論和技術(shù)引向深入 目前分子生物學(xué)研

3、究的前沿：功能基因組研究、基因表達(dá)調(diào)控研究、結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究不斷地與其他學(xué)科進(jìn)行深入的橫向聯(lián)系和交叉融合 分子、細(xì)胞、整體水平的研究得到和諧統(tǒng)一表型和基因型的關(guān)系得到客觀準(zhǔn)確解釋分子生物學(xué)與其他學(xué)科的結(jié)合生理學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、廣泛滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ)預(yù)防醫(yī)學(xué)分子細(xì)胞學(xué) 分子藥理學(xué) 分子免疫學(xué) 分子病理學(xué)分子病毒學(xué) 分子神經(jīng)學(xué) 分子細(xì)菌學(xué) 分子遺傳學(xué) 分子流行病學(xué) 分子內(nèi)分泌學(xué) 分子診斷學(xué)（基因診斷學(xué)） 分子治療學(xué)（基因治療學(xué)） 廣泛的滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域，大大促進(jìn)了醫(yī)學(xué)的發(fā)展四、分子生物學(xué)發(fā)展簡史準(zhǔn)備和醞釀階段現(xiàn)

4、代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段初步認(rèn)識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段準(zhǔn)備和醞釀階段( 19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初 )在這一階段產(chǎn)生了兩點(diǎn)對生命本質(zhì)的認(rèn)識上的重大突破：確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)19世紀(jì)末 Buchner 兄弟證明酵母細(xì)胞提取液能使糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。20世紀(jì)20-40年代提純和結(jié)晶了一些酶（尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等），證明酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。1902年，Emil Fisher 證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽。40年代末，Sanger創(chuàng)立二硝基氟苯（DNFB）法分析肽

5、鏈N端氨基酸的方法，Edman 發(fā)展了異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸的方法，為蛋白質(zhì)測序奠定了基礎(chǔ)。1953年，Sanger和Thompson完成了第一個(gè)多肽分子-胰島素A鏈和B鏈氨基酸全序列分析。1950年，Pauling 和 Corey 提出了-角蛋白的- 螺旋結(jié)構(gòu)模型。這一階段對蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)都有了認(rèn)識生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA1868年, F.Miescher 就發(fā)現(xiàn)了核素（nuclein）20世紀(jì)20-30年代, 確認(rèn)自然界有DNA和RNA，并闡明了核苷酸的組成。由于當(dāng)時(shí)對核苷酸和堿基的定量分析不夠精確，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的結(jié)果，因而曾長期認(rèn)為：DN

6、A結(jié)構(gòu)只是“四核苷酸 ”單位的重復(fù)，不具有多樣性，不能攜帶更多的信息，當(dāng)時(shí)對攜帶遺傳信息的侯選分子更多的是考慮蛋白質(zhì)。40年代以后，人們對核酸的功能和結(jié)構(gòu)兩方面的認(rèn)識都有了長足進(jìn)步。1944年，O.T.Avery 等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA1952年，A.D.Hershey 和 M.Chase 用 35S 和32P 分別標(biāo)記 T2 噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了核酸是遺傳物質(zhì)。在對DNA結(jié)構(gòu)的研究上1949-1952年，Wilkins 等的X-線衍射分析闡明了核苷酸并非平面的空間構(gòu)像，提出了DNA是螺旋結(jié)構(gòu)1948-1953年，Chargaff等用新的層析和電泳技術(shù)

7、分析組成DNA的堿基和核苷酸量，積累了大量的數(shù)據(jù)，提出了DNA堿基組成A=T、G=C的Chargaff 規(guī)則，為堿基配對的DNA結(jié)構(gòu)認(rèn)識打下了基礎(chǔ)。現(xiàn)代分子生物學(xué)建立和發(fā)展階段（50年代初到70年代初）1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，是生物學(xué)發(fā)展的里程碑。它開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代，可以說是現(xiàn)代分子生物學(xué)的開始。在此期間的主要進(jìn)展包括：遺傳信息傳遞中心法則的建立對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識遺傳信息傳遞中心法則的建立在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)，Watson 和Crick 就提出DNA復(fù)制的可能模型1956年，A.Kornberg首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合

8、酶（DNA polymerase）1958年，Meselson及Stahl用同位素標(biāo)記和超速離心分離實(shí)驗(yàn)證明了DNA半保留復(fù)制模型1968年，Okazaki（岡崎）提出DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型1972年，證實(shí)了DNA復(fù)制開始需要RNA作為引物70年代初，發(fā)現(xiàn)了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，并對真核DNA聚合酶特性做了分析研究 逐漸完善了對DNA復(fù)制機(jī)理的認(rèn)識在研究DNA復(fù)制將遺傳信息傳給子代的同時(shí)，提出了RNA在遺傳信息從DNA傳到蛋白質(zhì)過程中起著中介作用的假說1958年，Weiss 及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的RNA聚合酶1961年，Hall和Spiegelman用RNA-DNA雜交證明mRNA

9、與DNA序列互補(bǔ)，闡明了 RNA轉(zhuǎn)錄合成的機(jī)理在此同時(shí)認(rèn)識到：蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的50年代初，Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細(xì)胞組分的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)微粒體（ microsome ）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位1957年，Hoagland 等分離出 tRNA；對 tRNA 在合成蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能提出了假設(shè)1961年，Brenner及Gross等觀察了在蛋白質(zhì)合成過程中mRNA與核糖體的結(jié)合1965年，Holley首次測出了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級結(jié)構(gòu)60年代，Nirenberg、Ochoa、Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了mRNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼隨后研究

10、表明：這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認(rèn)識了蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過程上述重要發(fā)現(xiàn)共同建立了以中心法則為基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)基本理論體系1970年，Temin和Baltimore從 雞肉瘤病毒 顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶，補(bǔ)充和完善了遺傳信息傳遞的中心法則 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識1956-58年，Anfinsen和White 提出了蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來確定的（牛胰核糖核酸酶的變性與復(fù)性實(shí)驗(yàn)）1958年，Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥病人的血紅蛋白之間，在亞基的肽鏈上僅有一個(gè)氨基酸殘基的差別。研究蛋白質(zhì)的手段也有改進(jìn)：1969年，We

11、ber開始應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量60年代，先后分析了血紅蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)1973年氨基酸序列自動(dòng)測定儀問世中國科學(xué)家1965年人工合成了牛胰島素1973年用1.8A X-線衍射法測定了牛胰島素的空間結(jié)構(gòu)初步認(rèn)識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段（70年代 ）70年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類開始了深入認(rèn)識生命本質(zhì)并能動(dòng)改造生命的新時(shí)期期間的重大成就包括： 重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展基因組研究的發(fā)展單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展1967-1970年，R Yua

12、n和HO Smith等發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，為基因工程提供了有力工具1972年，Berg等將 SV40 病毒 DNA與噬菌體 P22 DNA 在體外重組成功，并轉(zhuǎn)化了大腸桿菌，使本來在真核細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)能在細(xì)菌中合成， 打破了種屬界限1977年，Boyer 等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽。1978年，Itakura（板倉）等：人生長激素191肽在大腸桿菌中表達(dá)成功1979年，美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素我國已有人干擾素、人白介素 2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹

13、瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進(jìn)入生產(chǎn)或臨床試用。世界上還有幾百種基因工程藥物及其它基因工程產(chǎn)品在研制中，成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)發(fā)展的重要方向，將對醫(yī)學(xué)和工農(nóng)業(yè)發(fā)展作出新貢獻(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物和基因剔除動(dòng)植物的成功是基因工程技術(shù)發(fā)展的結(jié)果： 1982年，Palmiter等將克隆的生長激素基因?qū)胄∈笫芫鸭?xì)胞核內(nèi)，培育得到比原小鼠個(gè)體大幾倍的“巨鼠”，激起了人們創(chuàng)造優(yōu)良品系家畜的熱情。 我國水生生物研究所將生長激素基因轉(zhuǎn)入魚受精卵，得到的轉(zhuǎn)基因魚的生長顯著加快、個(gè)體增大。用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還能獲取治療人類疾病的重要蛋白質(zhì) 例如：導(dǎo)入了凝血因子基因的轉(zhuǎn)基因綿羊分泌的乳汁中含有豐富的凝血因子，能有效地用于血友病

14、的治療。在轉(zhuǎn)基因植物方面1994年，轉(zhuǎn)基因西紅柿投放市場1996年，轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆相繼投入商品生產(chǎn)我國科學(xué)家將自己發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入棉花獲得抗棉鈴蟲的棉花株1996年，全世界已有250萬公頃土地種植轉(zhuǎn)基因植物。基因診斷與基因治療是基因工程在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方面。1990年，美國向一患先天性免疫缺陷?。ㄟz傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內(nèi)導(dǎo)入重組的ADA基因，獲得成功我國也在1994年用導(dǎo)入人凝血因子基因的方法成功治療了乙型血友病的患者在我國，用作基因診斷的試劑盒已有近百種之多?；蛟\斷和基因治療正在發(fā)展之中。美國醫(yī)學(xué)家WF安德森等人對腺甘脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）

15、的基因治療，是世界上第一個(gè)基因治療成功的范例。1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩謝德爾進(jìn)行基因治療。這個(gè)4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產(chǎn)ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個(gè)女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經(jīng)過改造，有缺陷的基因已經(jīng)被健康的基因所替代。在以后的10個(gè)月內(nèi)她又接受了7次這樣的治療，同時(shí)也接受酶治療。經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，能夠走出隔離帳，過上了正常人的生活。深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制開發(fā)的抗癌新藥 “重組人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），2003年10月16日獲得國家

16、食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。.基因工程的迅速進(jìn)步得益于許多分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。1975-1977年，Sanger、Maxam和Gilbert先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測定法90年代，全自動(dòng)核酸序列測定儀的問世1985年，Cetus公司Mullis等發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體外核酸序列擴(kuò)增技術(shù)?；蚪M研究的發(fā)展目前分子生物學(xué)已經(jīng)從研究單個(gè)基因發(fā)展到研究生物整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)與功能1977年，Sanger測定了X174-DNA全部5375個(gè)核苷酸的序列；1978年，F(xiàn)iers等測出SV40 DNA全部5224對堿基序列80年代，噬菌體DNA序列全部測出（48,502 bp）一些

17、小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因組的全序列也陸續(xù)被測定1996年底，測出了大腸桿菌基因組DNA的全序列（4×10 6 bp ）測定一個(gè)生物基因組核酸的全序列無疑對理解這一生物的生命信息及其功能有極大的意義。1990年，人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）開始實(shí)施，這是生命科學(xué)領(lǐng)域有史以來全球性最龐大的研究計(jì)劃2001年2月，人類基因組（3.16 × 10 9 bp）全部DNA序列已完成。后基因組（post-genome）計(jì)劃、已經(jīng)啟動(dòng)1996年，許多科學(xué)家共同努力測出了大腸桿菌基因組DNA的全序列長4×10 6 堿基對測定一個(gè)

18、生物基因組核酸的全序列無疑對理解這一生物的生命信息及其功能有極大的意義轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型和拷貝數(shù)。 RNA的生物學(xué)功能遠(yuǎn)超出遺傳信息傳遞作用的范圍，除mRNA、tRNA、rRNA外，一類小分子RNA受到廣泛重視，已發(fā)現(xiàn)小分子RNA可參與基因表達(dá)調(diào)控，所有小分子RNA統(tǒng)稱非mRNA小RNA(snmRNA)，由此產(chǎn)生RNA組學(xué)的概念，主要研究snmRNA的種類、結(jié)構(gòu)和功能等，探討同一生物不同組織細(xì)胞或同一細(xì)胞在不同時(shí)空狀態(tài)下snmRNA的表達(dá)譜，及其功能的變化。代謝組學(xué)（metabolomics）研究的是生物體對外源性物質(zhì)的刺激、環(huán)

19、境變化或遺傳修飾所做出的所有代謝應(yīng)答的全貌和動(dòng)態(tài)變化過程。 研究對象是完整的多細(xì)胞生物系統(tǒng)，包括生命個(gè)體與環(huán)境的相互作用。 代謝組學(xué)著重研究生物個(gè)體在疾病發(fā)生發(fā)展過程中和外源性物質(zhì)如藥物作用下代謝的整體變化。疾病代謝組學(xué)的研究著重于尋找疾病發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)記與指紋信息。糖組學(xué)（glycomics）主要研究單個(gè)生物體所包含的所有聚糖的結(jié)構(gòu)、功能等生物學(xué)作用。糖組學(xué)的出現(xiàn)使人類可以更深刻理解第三類生物信息大分子聚糖在生命活動(dòng)中的作用。單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展1975年，Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體以來，人們利用這一細(xì)胞工程技術(shù)研制出多種單克隆

20、抗體80年代以后，隨著基因工程抗體技術(shù)而相繼出現(xiàn)的單域抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、重構(gòu)抗體、雙功能抗體等為廣泛和有效的應(yīng)用單克隆抗體提供了廣闊的前景?；虮磉_(dá)調(diào)控機(jī)理1961年，Jacob 和Monod提出操縱子學(xué)說。在分子遺傳學(xué)基本理論建立的60年代，人們主要認(rèn)識了原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一些規(guī)律：操縱子機(jī)制。70年代以后，才逐漸認(rèn)識了真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的復(fù)雜性。1977年，最先發(fā)現(xiàn)猴SV40和腺病毒中編碼蛋白質(zhì)的基因序列是不連續(xù)的。基因內(nèi)部的間隔區(qū)（內(nèi)含子）在真核基因組中普遍存在，揭開了認(rèn)識真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕。1981年，Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA的自我剪接功能，從而發(fā)現(xiàn)了核酶（r

21、ibozyme）80-90年代，人們逐步認(rèn)識到真核基因的表達(dá)調(diào)控方式：順式作用元件（cis acting element）反式作用因子（trans acting factor）核酸與蛋白質(zhì)間的分子識別與相互作用是基因表達(dá)調(diào)控根本所在。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究成為新的前沿領(lǐng)域1957年，Sutherland 發(fā)現(xiàn)cAMP1965年，提出第二信使學(xué)說1977年Ross等證實(shí)G蛋白的存在和功能，將G蛋白與腺苷環(huán)化酶的作用相聯(lián)系起來，深化了對G蛋白偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究、各種受體蛋白基因的克隆和結(jié)構(gòu)功能的探索等，使近10年來細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究更有了長足的進(jìn)步。EH Fischer和EG Krebs發(fā)現(xiàn)可逆性的蛋白磷酸化過程是生物的自身調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的不平衡可導(dǎo)致疾病的發(fā)生可逆性的蛋白磷酸化過程是蛋白質(zhì)相互作用的一個(gè)重要調(diào)節(jié)機(jī)制，該過程需要很多酶作催化劑。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有數(shù)千種蛋白質(zhì)，它們是機(jī)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。這些蛋白質(zhì)