基因工程制胰島素(生工版)

1、2021-11-19用基因工程方法用基因工程方法獲得胰島素獲得胰島素第四組12021-11-19胰島素是由胰島B細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來(lái)糖尿病治療。胰島素這類活性蛋白多肽和細(xì)胞因子具有高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，體外難以人工合成。所以過(guò)去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來(lái)治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個(gè)氨基酸殘基不同，長(zhǎng)期服用會(huì)引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人

2、胰島素進(jìn)行治療。22021-11-193基因工程制胰島素三種方法一、A鏈和B鏈分別表達(dá)法化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列2021-11-194基因工程制胰島素三種方法一、A鏈和B鏈分別表達(dá)法表達(dá)產(chǎn)物的后期處理路線：2021-11-195基因工程制胰島素三種方法二、人胰島素原表達(dá)法基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：2021-11-196基因工程制胰島素三種方法二、人胰島素原表達(dá)法表達(dá)產(chǎn)物的后期處理路線：2021-11-197基因工程制胰島素三種方法三、A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法2021-11-198方法一： 由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對(duì)率較低，通常只有10% - 20%，因此成本高。方

3、法二： 胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)率提高，折疊率高。工藝路線依然繁瑣。方法三： 需體外折疊?；蚬こ讨埔葝u素三種方法三種方法比較：2021-11-19基因工程獲取胰島素的步驟基因工程獲取胰島素的步驟一、獲取外源目的基因片段二、選擇與獲取表達(dá)載體三、重組目的DNA片段與表達(dá)載體四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞五、重組體導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞六、對(duì)重組體細(xì)胞進(jìn)行篩選純化鑒定七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存八、發(fā)酵培養(yǎng)92021-11-19一、獲取外源目的基因片段1選擇實(shí)驗(yàn)材料2提取RNA，分離RNA3逆轉(zhuǎn)錄mRNA,得cDNA第一鏈4得雙鏈DNA5DNA序列糾錯(cuò)6. 目的基因通過(guò)細(xì)胞克隆擴(kuò)增7. 目的

4、基因回收及DNA測(cè)序，最終目的基因獲取102021-11-19一、獲取外源目的基因片段1選擇實(shí)驗(yàn)材料胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素，體內(nèi)胰島素是胰島B細(xì)胞（即胰島細(xì)胞）受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。胰島素基因只有在胰島B細(xì)胞中才能轉(zhuǎn)錄出信使RNA，所以用基因工程方法生產(chǎn)胰島素時(shí)，選用胰島B細(xì)胞為獲取目的基因的實(shí)驗(yàn)材料。112021-11-19一、獲取外源目的基因片段2提取RNA，分離RNA 21 總RNA的提取 22 mRNA的純化 23 mRNA的保存122021-11-19一、獲取外源目的基因片段21 總RNA的提取 總RNA的抽提方法有多種，TR

5、Izol試劑是使用組廣泛的RNA抽提試劑，主要由苯酚和異硫氰酸胍組成，可以迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使存在于細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)的RNA釋放出來(lái)，并使核糖體蛋白與RNA分子分離。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8羥基喹啉、異硫氰酸胍、-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。TRIzol是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過(guò)程中，TRIzol能保持RNA完整性。提取RNA時(shí)，首先用液氮研磨材料，勻漿，加入TRIzol試劑，進(jìn)一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分。然后加入氯仿抽提，離心，分離水相和有機(jī)相，收集含有RNA的水相，通過(guò)異丙醇沉淀，

6、可獲得比較純的總RNA，用于下一步mRNA的純化。132021-11-19一、獲取外源目的基因片段211 TRIzol法提取流程（1）樣品處理 培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞1-5*107，移入1.5ml離心管中，加入1ml TRIzol，混勻，室溫靜置5min。 組織：取50-100mg組織（新鮮或-70及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1ml TRIzol充分勻漿，室溫靜置5min。（2）加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。（3）4離心，12000g*15min，取上清液。（4）加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。（5）4離心，12000g*10mi

7、n，棄上清液。（6）加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4，7500g*5min，棄上清液。（7）晾干，加入適量的DEPCH2O溶解（65促溶10-15min）。142021-11-19一、獲取外源目的基因片段211 TRIzol法提取流程圖152021-11-19一、獲取外源目的基因片段22 mRNA的純化該方法利用mRNA 3端含有PolyA（多聚腺苷酸）的特點(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異性的結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過(guò)兩次寡聚纖維柱后可得到較高純度的mRNA。162021-11-19一、獲取外源目的基因片段2 22 21

8、1 寡聚（寡聚（dTdT）纖維素柱純化）纖維素柱純化mRNAmRNA（1 1）試劑準(zhǔn)備：）試劑準(zhǔn)備： 3M3M醋酸鈉（醋酸鈉（pH5.2pH5.2）；）； 0.1M NaOH0.1M NaOH； 上樣緩沖液：上樣緩沖液：20mM Tris-HCl20mM Tris-HCl（pH7.6pH7.6）,0.5M NaCl,1M ,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉十二烷基氨酸鈉) )。配制時(shí)可先配制。配制時(shí)可先配制Tris-HClTris-HCl（pH7.6pH7.6）、）、NaClNaCl、EDTAEDTA（

9、pH8.0pH8.0）的母液，經(jīng)高壓）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至6565，加入經(jīng)，加入經(jīng)6565溫育（溫育（30min30min）的）的10%SLS10%SLS至終濃度為至終濃度為0.1%0.1%； 洗脫緩沖液：洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl10mM Tris-HCl（pH7.6pH7.6），），1mM EDTA1mM EDTA（pH8.0pH8.0），），0.05%SDS0.05%SDS； 無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醇、70%70%乙醇；乙醇； DEPCDEPC（0.1%0.1%焦炭酸二乙酯）焦炭酸二乙酯）

10、 172021-11-19一、獲取外源目的基因片段221 寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（2 2）操作步驟：）操作步驟： 將將0.5-1.0g0.5-1.0g寡聚（寡聚（dTdT）纖維懸浮于）纖維懸浮于0.1M0.1M的的NaOHNaOH溶液中。溶液中。 用用DEPCDEPC處理的處理的1ml 1ml 注射器或適當(dāng)?shù)募?xì)管，將寡聚（注射器或適當(dāng)?shù)募?xì)管，將寡聚（dTdT）纖維素裝柱）纖維素裝柱0.5-1ml0.5-1ml，用，用3 3倍柱床體積的倍柱床體積的DEPCH2ODEPCH2O洗柱。洗柱。 使用使用1 1* *上樣緩沖液洗柱，直至洗出液上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pHpH值小于值小于8.0

11、8.0。 將將RNARNA溶解于溶解于DEPCH2ODEPCH2O中，在中，在6565中溫育中溫育10min10min左右，冷卻至室溫后加入等體左右，冷卻至室溫后加入等體2 2* *上樣上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)RNARNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1 1* *上樣上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。 將所有流出液于將所有流出液于6565加熱加熱5min5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。 用用5-105-10倍柱床體積的倍柱床體積的1 1* *上

12、樣緩沖液洗柱，每管上樣緩沖液洗柱，每管1ml1ml分步收集，分步收集，OD260OD260測(cè)定測(cè)定RNARNA含量。含量。前部分收集管中流出液的前部分收集管中流出液的OD260OD260值很高，其內(nèi)含物為無(wú)值很高，其內(nèi)含物為無(wú)polyApolyA尾的尾的RNARNA。后部分收集管。后部分收集管中流出液的中流出液的OD260OD260值很低或無(wú)吸收。值很低或無(wú)吸收。 用用2-32-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫polypoly（A+A+）RNARNA，分步收集，每部分為，分步收集，每部分為1/3-1/21/3-1/2柱柱體積。體積。 OD260OD260測(cè)定測(cè)定polypol

13、y（A+A+）RNARNA分布，合并含分布，合并含polypoly（A+A+）RNARNA的收集管，加入的收集管，加入1/101/10體積體積3M 3M NaAcNaAc（pH5.2pH5.2）、）、2.52.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-20-20放置放置30min30min。 44離心，離心，10000g10000g* *15min15min，小心吸棄上清。用，小心吸棄上清。用70%70%乙醇洗滌沉淀。乙醇洗滌沉淀。44離心，離心，10000g10000g* *5min5min，棄上清，室溫晾干。，棄上清，室溫晾干。 用適量的用適量的DEPCH2ODEPCH2

14、O溶解溶解RNARNA。182021-11-19一、獲取外源目的基因片段221 寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（3 3）注意事項(xiàng)）注意事項(xiàng) 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須防止整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須防止RnaseRnase的污染。的污染。 步驟中將步驟中將RNARNA溶液置溶液置6565中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNARNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA polymRNA poly（A+A+）尾處的二）尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使級(jí)結(jié)構(gòu)，使polypoly（A+A+）尾充分暴露，從而提高）尾充分暴露，從而提高polypoly（A+A+）

15、RNARNA的回收率；的回收率；另一個(gè)目的是能解離另一個(gè)目的是能解離mRNAmRNA與與rRNArRNA的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致rRNArRNA的污染。所的污染。所以此步驟不能省略。以此步驟不能省略。 十二烷基肌氨酸鈉鹽在十二烷基肌氨酸鈉鹽在1818以下溶解度下降，會(huì)阻礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，以下溶解度下降，會(huì)阻礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，若室溫低于若室溫低于1818最好用最好用LiClLiCl替代替代NaClNaCl。 寡聚（寡聚（dTdT）纖維素柱可在）纖維素柱可在44貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用次用NaOHNaOH、滅菌、滅菌ddH2OddH2O、上樣緩沖

16、液洗柱。、上樣緩沖液洗柱。 一般而言，一般而言，107107哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5g poly1-5g poly（A+A+）RNARNA，約相當(dāng)于上柱總約相當(dāng)于上柱總RNARNA量的量的1%-2%1%-2%。192021-11-19一、獲取外源目的基因片段23 mRNA的保存用少量水溶解mRNA，即可用于cDNA合成或保存在70%乙醇中并于-70下貯存。202021-11-19一、獲取外源目的基因片段胰島素基因胰島素基因mRNAmRNA序列序列212021-11-19一、獲取外源目的基因片段胰島素基因胰島素基因mRNAmRNA序列序列NCBINCBI中搜索得2220

17、21-11-19一、獲取外源目的基因片段3逆轉(zhuǎn)錄mRNA,得cDNA第一鏈 mRNAmRNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下由引物引導(dǎo)合成在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下由引物引導(dǎo)合成cDNAcDNA。加入高濃度的加入高濃度的 OligoOligo（dTdT）引物，）引物， ，OligoOligo（dTdT）引）引物與物與 mRNAmRNA 的的 33 末端的末端的 polypoly（A A）配對(duì)，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)）配對(duì)，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以錄酶以 mRNAmRNA 為模板合成第一鏈為模板合成第一鏈 cDNAcDNA 。這種這種 cDNAcDNA 合成的方法在合成的方法在 cDNAcDNA 文庫(kù)構(gòu)建中應(yīng)用極為文庫(kù)構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其

18、缺點(diǎn)主要是由于普遍，其缺點(diǎn)主要是由于 cDNAcDNA 末端存在較長(zhǎng)末端存在較長(zhǎng)的的 polypoly（A A）而影響）而影響 cDNAcDNA 測(cè)序。（原因：測(cè)序。（原因：oligo oligo （ dT dT ）結(jié)合在）結(jié)合在 mRNA mRNA 的的 3 3 端，因此合成全長(zhǎng)的端，因此合成全長(zhǎng)的 cDNA cDNA 需要反轉(zhuǎn)錄酶從需要反轉(zhuǎn)錄酶從 mRNA mRNA 分子的一端移動(dòng)到另一分子的一端移動(dòng)到另一端，有時(shí)這種全合成難以達(dá)到）端，有時(shí)這種全合成難以達(dá)到）232021-11-19一、獲取外源目的基因片段4得雙鏈DNA 4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNA 4.2將DNA雙鏈通過(guò)PCR

19、技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增 242021-11-19一、獲取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNA mRNAmRNAcDNAcDNA 雜合雙鏈中的雜合雙鏈中的 mRNAmRNA 鏈在鏈在 RNARNA 酶酶 HH 作用下先形成很多切作用下先形成很多切口，口， mRNAmRNA 鏈就被切割成很多的小片段，這些小片段為大腸桿菌鏈就被切割成很多的小片段，這些小片段為大腸桿菌 DNADNA 聚聚合酶合酶 提供了合成第二鏈的引物。大腸桿菌提供了合成第二鏈的引物。大腸桿菌 DNADNA 聚合酶聚合酶 以第一以第一鏈鏈 cDNAcDNA 為模板合成一段段互補(bǔ)的為模板合成一段段互補(bǔ)的 cDNAcDNA 片段。

20、這些片段。這些 cDNAcDNA 片段進(jìn)而片段進(jìn)而在在 DNADNA 連接酶的作用下連接成一條鏈，即連接酶的作用下連接成一條鏈，即 cDNAcDNA 的第二鏈。遺留在的第二鏈。遺留在 5-5-末端的一段很小的末端的一段很小的 mRNAmRNA 也被大腸桿菌也被大腸桿菌 DNADNA 聚合酶聚合酶 的的 5533 核核酸外切酶和酸外切酶和 RNARNA 酶酶 HH 降解，暴露出與第一鏈降解，暴露出與第一鏈 cDNAcDNA 對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)的 3-3-端部分端部分序列。同時(shí)，大腸桿菌序列。同時(shí)，大腸桿菌 DNADNA 聚合酶聚合酶 的的 3-53-5 核酸外切酶的活性可核酸外切酶的活性可將暴露出的第一

21、鏈將暴露出的第一鏈 cDNAcDNA 的的 3-3-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端部分消化掉，形成平端或差不多的平端端優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): : a) a)合成合成cDNAcDNA的效率高的效率高 b)b)直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物, ,不需純化不需純化 c)c)避免使用避免使用S1S1核酸酶來(lái)切割雙鏈核酸酶來(lái)切割雙鏈cDNAcDNA252021-11-19一、獲取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNA 262021-11-19一、獲取外源目的基因片段4.2將DNA雙鏈通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增 4.2.14.2.1模板模板DNADNA的變性的變性向離心管加入模板、引

22、物、耐熱的向離心管加入模板、引物、耐熱的DNADNA聚合酶、聚合酶、PCRPCR緩沖液（緩沖液（ 500mm01500mm01L KClL KCl；100mmol100mmolL TrisL Tris一一HCl(pH8.4)HCl(pH8.4)，150mmol150mmolL L MgCl2MgCl2，lmglmgm1m1明膠）、明膠）、5mmo15mmo1L dNTPL dNTP貯備貯備液，然后加熱至液，然后加熱至9393左右一定時(shí)間后，使模左右一定時(shí)間后，使模板板DNADNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNADNA解離，解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下

23、輪使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備反應(yīng)作準(zhǔn)備272021-11-19一、獲取外源目的基因片段4.2將DNA雙鏈通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增 4.2.24.2.2模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性) )模板模板DNADNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至5555左右，引物與模板左右，引物與模板DNADNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合合；282021-11-19一、獲取外源目的基因片段4.2將DNA雙鏈通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增 4.2.34.2.3引物的延伸引物的延伸DNADNA模板模板-引物結(jié)合引物結(jié)合 物在物在TaqDNAT

24、aqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下，以用下，以dNTPdNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板的與模板DNA DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性循環(huán)變性-退火退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更延伸三過(guò)程，就可獲得更多的多的“半保留復(fù)制鏈半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2 24 4分鐘，分鐘，2 23 3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。增放大幾

25、百萬(wàn)倍。292021-11-19一、獲取外源目的基因片段5.目的基因回收純化及DNA測(cè)序糾錯(cuò) 5.1 將目的基因進(jìn)行回收純化 5.2 對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序 5.3 DNA序列糾錯(cuò)302021-11-19一、獲取外源目的基因片段 5.1 將目的基因進(jìn)行回收純化1) 1) 在在PCRPCR試管中加入凝膠緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳電泳到試管中加入凝膠緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳電泳到適當(dāng)位置后在目的適當(dāng)位置后在目的DNADNA條帶的前端挖一長(zhǎng)方形槽，向槽中條帶的前端挖一長(zhǎng)方形槽，向槽中加入融化的低熔點(diǎn)膠，待凝固后進(jìn)行電泳。加入融化的低熔點(diǎn)膠，待凝固后進(jìn)行電泳。2 2）當(dāng)）當(dāng)DNADNA進(jìn)入低熔點(diǎn)膠中心時(shí)停止

26、電泳。紫外燈下切下目的進(jìn)入低熔點(diǎn)膠中心時(shí)停止電泳。紫外燈下切下目的條帶的低熔點(diǎn)膠。條帶的低熔點(diǎn)膠。 3) 3) 將切下的膠放到離心管中，加入將切下的膠放到離心管中，加入200200的緩沖液，的緩沖液，6565溫浴溫浴3 3分鐘以融化低熔點(diǎn)膠。分鐘以融化低熔點(diǎn)膠。4) 4) 然后分別用酚然后分別用酚/ /氯仿，氯仿抽提一次。取上清，加入氯仿，氯仿抽提一次。取上清，加入2 2倍體倍體積的無(wú)水乙醇，積的無(wú)水乙醇，-20-20沉淀沉淀DNA 2hDNA 2h以上，以上，12 000rpm12 000rpm離心離心15min15min，棄上清，用，棄上清，用70%70%乙醇洗滌，吹干后溶于乙醇洗滌，吹干

27、后溶于10l10l無(wú)菌無(wú)菌水中。水中。注意事項(xiàng)：在紫外燈下切出含有目的注意事項(xiàng)：在紫外燈下切出含有目的DNA DNA 片段的瓊脂糖凝膠片段的瓊脂糖凝膠時(shí)應(yīng)注意要快速操作，以免損傷。時(shí)應(yīng)注意要快速操作，以免損傷。312021-11-19一、獲取外源目的基因片段 5.2 對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序利用利用DNADNA聚合酶，以待測(cè)單鏈聚合酶，以待測(cè)單鏈DNADNA為模板，以為模板，以dNTPdNTP為底為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的體系中加入不同的ddNTPddNTP作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下

28、，按照堿基配對(duì)原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合引物引導(dǎo)下，按照堿基配對(duì)原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長(zhǎng)短不一的引物延伸鏈，通過(guò)高分辨率的變成一系列長(zhǎng)短不一的引物延伸鏈，通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按凝膠底部到頂部按55至至33方向讀出新合成鏈序列，方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列。由此推知待測(cè)模板鏈的序列。322021-11-19一、獲取外源目的基因片段 5.2 對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序332021-11-19一、獲取外源目的基因片段 5.3 DNA序列糾錯(cuò)1 1、將待突變基因克隆到突變載體上；、將待突

29、變基因克隆到突變載體上；2 2、制備含突變基因的單鏈模板；、制備含突變基因的單鏈模板；3 3、人工合成一段改變了堿基順序的寡核苷酸片段，、人工合成一段改變了堿基順序的寡核苷酸片段，以此作為引物，在體外合成互補(bǔ)鏈，獲得含有錯(cuò)配堿以此作為引物，在體外合成互補(bǔ)鏈，獲得含有錯(cuò)配堿基的完整雙鏈基的完整雙鏈M13DNAM13DNA4 4、轉(zhuǎn)化和初步篩選異源雙鏈、轉(zhuǎn)化和初步篩選異源雙鏈DNADNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，產(chǎn)生野生型、突變型的同源雙鏈產(chǎn)生野生型、突變型的同源雙鏈DNADNA分子。分子。5 5、用誘變的寡核苷酸引物作為探針，通過(guò)雜交即可、用誘變的寡核苷酸引物作為探針，通過(guò)雜交即可

30、鑒定出突變體鑒定出突變體 342021-11-19一、獲取外源目的基因片段6、目的基因通過(guò)細(xì)胞克隆擴(kuò)增6.1 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合6.2 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增6.3 篩選獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆352021-11-19一、獲取外源目的基因片段6.1 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口；將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性個(gè)切口；將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)；在連接酶的作用末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)；在連接酶的作用下連接形成重組下連接形成重組DN

31、ADNA分子。分子。362021-11-19一、獲取外源目的基因片段6.2 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增要讓目的基因表達(dá)，必須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)要讓目的基因表達(dá)，必須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增。為獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，通常以大腸桿菌增。為獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，通常以大腸桿菌等無(wú)害易得的細(xì)菌為受體。等無(wú)害易得的細(xì)菌為受體。注意：注意：為改進(jìn)某種生物時(shí)，將欲改進(jìn)的生物細(xì)胞為受為改進(jìn)某種生物時(shí)，將欲改進(jìn)的生物細(xì)胞為受體。為使重組的體。為使重組的DNADNA分子更容易進(jìn)入受體細(xì)胞，通常分子更容易進(jìn)入受體細(xì)胞，通常還要用一些物質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行處理，使受體細(xì)胞具還要用一些物質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)

32、行處理，使受體細(xì)胞具有更大的通透性，例如改變有更大的通透性，例如改變PHPH值，加入氯化鈣等。值，加入氯化鈣等。372021-11-19一、獲取外源目的基因片段6.3 篩選獲得重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆前幾步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利前幾步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來(lái)接受不多的目的基因。用，通常用大量的受體細(xì)胞來(lái)接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)

33、菌落中是否有目的基因的胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。多細(xì)胞生物的檢測(cè)，將每個(gè)受的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。多細(xì)胞生物的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）?，F(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。382021-11-19一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測(cè)序，最終目的基因獲取7.1 7.1 內(nèi)容物釋放內(nèi)容物釋

34、放將培養(yǎng)物加入試管，加入將培養(yǎng)物加入試管，加入EDTAEDTA及去污劑（），及去污劑（），用堿處理細(xì)菌，使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)用堿處理細(xì)菌，使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（在強(qiáng)堿環(huán)境下，宿主菌的線性雙鏈容物（在強(qiáng)堿環(huán)境下，宿主菌的線性雙鏈DNADNA片段中片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒DNADNA共價(jià)閉合環(huán)共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離）。狀的雙鏈并不完全分離）。392021-11-19一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測(cè)序，最終目的基因獲取7.2 7.2 加酸、離心加酸、離心然后加入高濃度酸性鹽，然后加入高濃度酸性鹽，PH

35、PH恢復(fù)至中性（變性的染色恢復(fù)至中性（變性的染色體體DNADNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物，而質(zhì)粒分子不溶性沉淀物，而質(zhì)粒DNADNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，能又恢復(fù)天然構(gòu)型，能溶解在上清液中），通過(guò)離心把染色體溶解在上清液中），通過(guò)離心把染色體DNADNA，蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)- -SDSSDS復(fù)合物等一起除去。復(fù)合物等一起除去。402021-11-19一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測(cè)序，最終目的基因獲取7.3 7.3 切割、電泳切割、電泳利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別DNADNA特異的核苷酸序列

36、，特異的核苷酸序列，并切割并切割DNADNA，產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的，產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的DNADNA片段，通過(guò)電泳對(duì)酶片段，通過(guò)電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因412021-11-19一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測(cè)序，最終目的基因獲取7.4 7.4 回收純化、測(cè)序回收純化、測(cè)序?qū)δ康幕蜻M(jìn)行回收純化，再測(cè)序?qū)δ康幕蜻M(jìn)行回收純化，再測(cè)序422021-11-19二.表達(dá)載體的構(gòu)建 pET28apET28a（含有T7噬菌體啟動(dòng)子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、His6標(biāo)簽序列、凝血酶切割位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、T7噬菌體終止子、乳糖阻遏序列、pBR322復(fù)制子o

37、ri、fl噬菌體復(fù)制子、卡那霉素篩選標(biāo)記序列等。）432021-11-19二.表達(dá)載體的構(gòu)建44原因： 1.T7噬菌體啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等引導(dǎo)目的基因高效轉(zhuǎn)錄和翻譯。 2.乳糖操縱子和乳糖阻遏序列存在的意義主要在于，當(dāng)目的蛋白對(duì)大腸桿菌有毒性的時(shí)候，可以通過(guò)添加阻遏物，控制目的蛋白以較低水平表達(dá)。 3.His6標(biāo)簽序列、凝血酶切割位點(diǎn)存在的意義主要在于方便利用針對(duì)His6的整合層析分離純化蛋白、然后利用凝血酶去除切割標(biāo)簽蛋白。 4.卡那霉素抗性基因編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。2021-11-19二.表達(dá)載體的構(gòu)建452021-11-19三.重組目的

38、DNA片段和表達(dá)載體 用用T7T7噬菌體噬菌體DNADNA連接酶將質(zhì)粒連接酶將質(zhì)粒載體載體pET28apET28a經(jīng)經(jīng)EcoREcoR和和BamHBamH 酶切的片段與目的基因經(jīng)酶切的片段與目的基因經(jīng)EcoREcoR和和BamHBamH 酶切的片段酶切的片段連接起來(lái)，構(gòu)成重組連接起來(lái)，構(gòu)成重組DNADNA分子。分子。 使用雙酶切：使用雙酶切：DNADNA分子重組時(shí)分子重組時(shí)為了保證目的片段以正確的方為了保證目的片段以正確的方向連接進(jìn)入載體，往往盡可能向連接進(jìn)入載體，往往盡可能選擇兩種具有不同黏性末端的選擇兩種具有不同黏性末端的酶分別酶切目的酶分別酶切目的DNADNA分子和載分子和載體，這種雙酶

39、切雖然使載體和體，這種雙酶切雖然使載體和目的目的DNADNA都產(chǎn)生兩種不同的黏都產(chǎn)生兩種不同的黏性末端，但是連接酶會(huì)選擇把性末端，但是連接酶會(huì)選擇把相同的黏性末端連接起來(lái)，從相同的黏性末端連接起來(lái)，從而保證目的基因只以一個(gè)方向而保證目的基因只以一個(gè)方向連接入載體。連接入載體。46四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞1、選擇大腸桿菌2、培養(yǎng)大腸桿菌2021-11-1947四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞1、選擇大腸桿菌原因：1）繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定2）基因克隆及表達(dá)系統(tǒng)成熟完善3）全基因組測(cè)序完成，共有4405個(gè)開放性閱讀框架4）被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物2021-11-1948四、選擇

40、與獲取表達(dá)細(xì)胞 開放閱讀框（ORF）是生物個(gè)體的基因組中，可能是蛋白質(zhì)編碼序列的部分?；蛑械腛RF包含并位于開始編碼與終止編碼之間。由于一段DNA或RNA序列有多種不同讀取方式，因此可能同時(shí)存在許多不同的開放閱讀框架。開放閱讀框包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，不能被終止子打斷。2021-11-19492、大腸桿菌的培養(yǎng)（1）LB（Luria-Bertain)液體培養(yǎng)基配制精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%氯化鈉1.0%攪拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培養(yǎng)基）調(diào)pH至7.0，如用進(jìn)口試劑可不

41、必調(diào)， 高壓滅菌20min(120 0.1Mpa) 四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞2021-11-1950四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞2021-11-1951（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 組成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,瓊脂 1520g,水1000mL,PH7.47.6。具體配置步驟： 1.稱藥品 按實(shí)際用量計(jì)算后,按配方稱取各種藥品放入大燒杯中.牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量,用熱水溶解后倒入大燒杯;也可放在稱量紙上稱量,隨后放入熱水中,牛肉膏使與稱量紙分離,立即取出紙片.蛋白胨極易吸潮,故稱量時(shí)要迅速。四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞2021-11-1952具體配置步驟： 2.加熱溶解 在燒

42、杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量.若配制固體培養(yǎng)基,則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中,再加熱融化,此過(guò)程中,需不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最后補(bǔ)足所失的水分。 3. 調(diào)pH 檢測(cè)培養(yǎng)基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,邊加邊攪拌,并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè),直至達(dá)到所需pH范圍.若偏堿,則用lmol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié).pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前.應(yīng)注意pH值不要調(diào)過(guò)頭,以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞2021-11-1953具體配置步驟： 4.過(guò)濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾,固體培養(yǎng)基

43、可用4層紗布趁熱過(guò)濾,以利培養(yǎng)的觀察.但是供一般使用的培養(yǎng)基,這步可省略。5.分裝 按實(shí)驗(yàn)要求,可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi).分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分裝量:固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5,滅菌后制成斜面.分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積的一半為宜.半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜,滅菌后垂直待凝。四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞2021-11-1954具體配置步驟： 6.加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞.棉塞的形狀,大小和松緊度要合適,四周緊貼管壁,不留縫隙,才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用.要使棉塞總長(zhǎng)約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi),

44、以防棉塞脫落.有些微生物需要更好的通氣,則可用8層紗布制成通氣塞.有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。 7.包扎 加塞后,將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙,以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞.若培養(yǎng)基分裝于試管中,則應(yīng)以5支或7支在一起,再于棉塞外包一層牛皮紙,用繩扎好.然后用記號(hào)筆注明,培養(yǎng)基名稱,組別,日期。 四、選擇與獲取表達(dá)細(xì)胞2021-11-1955具體配置步驟： 8.滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3濕熱滅菌20min.如因特殊情況不能及時(shí)滅菌,則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存。 9.無(wú)菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h,無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用,或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi),備用。 四、選擇與獲取表

45、達(dá)細(xì)胞2021-11-1956大腸桿菌培養(yǎng)：采用劃痕接種法。用接種環(huán)從菌種中沾取少量菌液，劃線。37攝氏度，恒溫培養(yǎng)48到72小時(shí)，因?yàn)榻臃N時(shí)和具體培養(yǎng)條件的不同，其生長(zhǎng)一般都在2天外才能長(zhǎng)出明顯的菌落。 菌落特征：乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和背面顏色一致。 五、重組DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞 氯化鈣轉(zhuǎn)化法氯化鈣轉(zhuǎn)化法 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌經(jīng)冰浴的氯化鈣低滲溶液處理，其細(xì)胞膜通透性增加，成為感受態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)），加入重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒與鈣離子形成復(fù)合物并粘附于細(xì)菌細(xì)胞膜表面，經(jīng)42熱休克處理，細(xì)胞膜通透性增加，重組質(zhì)粒DNA進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞

46、（導(dǎo)入重組體）。細(xì)菌在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，使含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞復(fù)原并表達(dá)抗生素抗性基因，涂布于含有抗生素的培養(yǎng)板上，生長(zhǎng)得到轉(zhuǎn)化子。2021-11-1957氯化鈣法轉(zhuǎn)化的原理機(jī)制：氯化鈣法轉(zhuǎn)化的原理機(jī)制：在0 的CaCl2 低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹， Ca2+ 使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中部分核酸酶解離，誘導(dǎo)形成感受態(tài)。此外，Ca 2+ 能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜的外表面；42 熱激處理，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動(dòng)，出現(xiàn)間隙。五、重組DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞2021-11-1958氯化鈣轉(zhuǎn)化法要點(diǎn)：氯化鈣轉(zhuǎn)化法

47、要點(diǎn)：1. 氯化鈣（二價(jià)鈣離子）的作用：提高細(xì)胞壁（膜）的通透性；2. 熱激后迅速轉(zhuǎn)移到冰上：促使質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入胞內(nèi)；3. 這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀DNA（質(zhì)粒），線型DNA不能采用此法。（在自然界自然發(fā)生的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞中的為單鏈DNA。）五、重組DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞2021-11-1959標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA、重組質(zhì)粒DNA、大腸桿菌JM109、離心機(jī)、0.1mol/L CaCl2 、LB培養(yǎng)基、微量移液器、微量離心管、抗生素、20mmol/L MgSO4、微孔濾膜及濾器、培養(yǎng)皿、三角瓶、恒溫水浴箱 、恒溫?fù)u床 、超凈工作臺(tái) 、玻璃涂布棒、95% 乙醇 實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：五、重組

48、DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞2021-11-1960注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度。用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。試劑的質(zhì)量。所用試劑均需要最高純度的，并用超純水新鮮配制，滅菌備用。防止雜菌和雜DNA的污染。五、重組DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞2021-11-1961二價(jià)鈣離子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響熱激溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響五、重組DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞2021-11-1962感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞的制備：1、從新活化的E.coli DH5平板上挑取一單菌落，接種于35ml LB液體培養(yǎng)中，37振蕩

49、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12h左右)；2、將該菌懸液以1:1001:50轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔2030min測(cè)一次OD600，至OD600為0.30.5時(shí)停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5 mL離心管中；3、培養(yǎng)物于冰上放置20min；4、 04，4000g離心10min，棄去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞, 冰浴20分鐘；五、重組DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞2021-11-19635、04， 4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min；6、

50、 04， 4000g離心10min，棄去上清液，加入100 L冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液； 制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，如果在4放置1224h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高46倍；也可加入占總體積15左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。五、重組DNA導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞2021-11-19642021-11-19六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定 在重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，由于重組率很低，因此需要從這些細(xì)胞中篩選出期望重組子，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于特定的固體培養(yǎng)板，生長(zhǎng)出的單菌落或

51、噬菌斑進(jìn)一步篩選和鑒定。652021-11-19 1、載體遺傳標(biāo)記法載體遺傳標(biāo)記法（抗生素抗性篩選法、營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法、噬菌斑篩選法、互補(bǔ)篩選法） 2、核酸分子雜交法核酸分子雜交法 菌落原位雜交：制備與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列，根據(jù)核酸雜交原理，探針序列特異性的雜交目的基因，并通過(guò)放射性同位素或熒光基團(tuán)進(jìn)行定位檢測(cè)。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定662021-11-19 3、目的基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定法目的基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定法 如果重組DNA的目的基因能在宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)，且宿主細(xì)胞本身不含該蛋白質(zhì)，那么可以通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)的生物功能或結(jié)構(gòu)來(lái)篩選和鑒定重組子。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定67 用

52、熒光原位標(biāo)記篩選重組體 1、制備核酸探針，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢所需的寡核苷酸探針的資料，用合成儀合成，然后用熒光素進(jìn)行標(biāo)記。 、將樣品進(jìn)行打碎、離心、清洗等步驟，使微生物細(xì)胞與雜質(zhì)進(jìn)行分離，同時(shí)增大細(xì)胞壁的通透性，保證探針?biāo)憷M(jìn)入與雜交。 、配置雜交液，其中雜交液中的甲酰胺的濃度直接影響雜交的特異性，將雜交液與樣品之一雜交爐（避光、密封），雜交完成后用洗脫液（或）將多余的探針除去。 、加少量的苯二胺甘油溶液覆蓋樣品，防止熒光淬滅，再封片，用熒光顯微鏡觀察、照相進(jìn)行分析。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定2021-11-1968熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交是一種非放射性原位雜交方法，將熒光標(biāo)記的探針與待測(cè)

53、序列進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)及類型達(dá)到診斷的目的。 原理：基于堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，用熒光素標(biāo)記的已知外源DNA或RNA作探針，與載玻片上的組織切片等雜交，與待測(cè)核酸的靶序列專一性結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)雜交位點(diǎn)熒光來(lái)顯示特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定2021-11-19692021-11-19產(chǎn)物1 1. .菌種菌種RRhPIZpQE-40 Ecoli M15菌株70七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-192 2. .材料與試劑材料與試劑 DEAE-Sepharose FF(瓊脂糖快流速陰離子交換劑)為杭州爭(zhēng)光樹脂有限公司產(chǎn)品,SephadexG-25為Sigma

54、公司產(chǎn)品，Superdex75為GE公司產(chǎn)品,溶菌酶、脫氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶B均為Sigma公司產(chǎn)品,谷胱甘肽氧化型(GSSG)和還原型(GSH)為上海博奧生物科技有限公司產(chǎn)品，二硫蘇糖醇(DTY)為Organics Inc產(chǎn)品,13-巰基乙醇和異丙基-13-D-巰基吡喃半乳糖苷(IPTG)為BB1分裝,胰蛋白胨、酵母粉（英國(guó)Oxiod公司）,氨芐青霉素（美國(guó)Sigma公司）,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。71七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-19培養(yǎng)基：（）LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0,pH 7.0;（）發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄

55、糖4,甘油15,酵母粉30,蛋白胨30,Na2HPO4 12,KH2PO4 6,NH4C l1,NaCl 2,MgSO4 0.48,pH 7.0;（）甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L):甘油300,酵母汁150,MgSO4 10,pH 7.0。所有培養(yǎng)基使用前均加入氨芐青霉素至終濃度50mg/L。水平恒溫?fù)u床（德國(guó)Therma公司）；BiostatB發(fā)酵系統(tǒng)（德國(guó)Braun公司）；蛋白質(zhì)電泳凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene公司）。72七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-193 3. .細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)菌培養(yǎng)和RRhPIRRhPI的表達(dá)的表達(dá) 采用二級(jí)發(fā)酵的方式，用正交法優(yōu)化培養(yǎng)條件，并將優(yōu)化條件用于

56、發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，收獲濕菌體。RRhPIZpQE-40 Ecoli M15的發(fā)酵罐培養(yǎng)：將lO lId經(jīng)過(guò)活化的RRhPIpQE-40 Ecoli M15轉(zhuǎn)移至100 ml培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，將其轉(zhuǎn)移至含有1.5L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)一段時(shí)間(轉(zhuǎn)速為300r/min，通氣量為1:1.5-1:1.8)，過(guò)程中加人一定量新鮮的培養(yǎng)基并用NaOH調(diào)節(jié)pH，之后加入IPTG并升溫誘導(dǎo)RRhPI的表達(dá)，轉(zhuǎn)速隨即調(diào)為400-500rmin，增大通氣量至1:1.8-1：2.0，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，收集菌體。73七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-194 4. .包涵體的收集和洗滌包涵體的收

57、集和洗滌 將收集的濕菌體凍存于-2O ，然后懸浮于緩沖液A(50mmol/L rifs-HC1，0.5mmol/L EDTA，50mmol/L NaC1，5 甘油，0.1-0.5mmol/LDTY，pH7.9)(5-6ml/g濕菌)中，加入溶菌酶(5mg/g濕菌體)，室溫或37振蕩2h。冰浴超聲10S30次，其間每次間隔20S，功率為200W。10條件下1000g離心5min去除細(xì)胞碎片。上清液中的包涵體(Inclusion body,IB)在4條件下27000g離心15min收集，然后用含2mol/L尿素的緩沖液A充分懸浮，室溫靜置30min后4條件下17000g離心15min，收集沉淀。沉

58、淀再用含2脫氧膽酸鈉的緩沖液A充分懸浮，4條件下17000g離心l5min，收集沉淀。最后沉淀用10mmol/L rifs-HC1,pH7.3洗滌兩次(4,17000g離心15min)。74七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-19 注意事項(xiàng)：細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的最大問(wèn)題就是容易形成不溶性的包涵體,它的形成對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的活性不利。75七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-19 包涵體(inclusionbody)是細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)互相凝集而形成的無(wú)活性固體顆粒。具有很強(qiáng)的折光性。正常的大腸桿菌基因以重組方法使其在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)也會(huì)形成包涵體。說(shuō)明不僅僅是外源蛋白才能形成包涵體,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有表達(dá)

59、量較低的基因產(chǎn)物也是以不可溶形式存在的。包涵體的形成不僅僅與宿主細(xì)胞、表達(dá)基因有關(guān),還與培養(yǎng)外環(huán)境有關(guān)系。其形成的原因多數(shù)認(rèn)為:目的基因的過(guò)度表達(dá)使蛋白質(zhì)無(wú)足夠時(shí)間進(jìn)行肽鏈折疊,產(chǎn)生凝集。重組蛋白所處的環(huán)境條件對(duì)包涵體也有較大影響,如當(dāng)溫度超過(guò)某一種蛋白質(zhì)的變性溫度時(shí),隨著溫度的增加凝集量也增加。當(dāng)環(huán)境PH接近某一種蛋白的等電點(diǎn)時(shí),蛋白的凝集增加,包涵體的形成也增多,此外,離子組成和強(qiáng)度、輔助因子、氧化還原電位等均可影響包涵體的形成。76七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-19 應(yīng)對(duì)方案： 改變發(fā)酵條件,如發(fā)酵溫度、培養(yǎng)的PH值等來(lái)減少重組蛋白的凝集,進(jìn)而有效控制包涵體的形成,給下游純化工

60、作創(chuàng)造有利條件。77七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2021-11-195 5. .RRhPIRRhPI的初步純化的初步純化 將收集的IB用含有0.1-0.313-巰基乙醇的緩沖液B(30mmol/L HC1,8mol/L尿素,pH8.0)溶解,上于已用緩沖液B平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用合適的氯化鈉梯度洗脫,收集含RRhPI的洗脫液。6 6. .RRhPIRRhPI的重組復(fù)性的重組復(fù)性 將初步純化后的RRhPI通過(guò)Sephadex G-25脫尿素,轉(zhuǎn)換緩沖液為不同pH的50mmol/L Gly-NaOH重組液,或含有適量GSSG的Gly-NaOH緩沖液中,使蛋白終濃度為0.1-0.