Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定步驟

1、biolog微生物鑒定步驟檢測原理biolog微生物鑒立系統(tǒng)測試的是微生物在鑒定板屮利用或氧化化和物的能力。測試會產生特征性的紫色孔模式，組成代謝指紋。 所有必需的營養(yǎng)物質和生化試劑都預先加進96孔板中，四呻紫是一種氧化還原染料，指示碳源的利用情況。.鑒能步驟非常簡單， 純化分離到的菌株經擴人培養(yǎng)，再制成接種液加到鑒定板屮。在培養(yǎng)過程屮，一些孔屮的化學物質能被氧化并將顯色物質成紫色, 對照孔（al）和陰性孔仍然為無色。鑒定板在相應的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)46小時或1624小時r卩可形成代謝模式。系統(tǒng)軟件自動和數 據庫對比，如果能找到合適的匹配，就可以得出一個鑒定結果。二所需器材和消耗品：.培養(yǎng)基、接種

2、液、疏基乙酸鈉、長棉簽、接種棒、儲液槽、八道移液器、移液器頭、濁度儀、濁度標準品、控溫培養(yǎng)箱和相應的鑒 定板。具中接種液自行配制，接種棒、儲液槽可選用國產品牌代替。鑒定步羽biolog微生物鑒定樣品處理步驟分離純化培養(yǎng) 基bug+b通用培養(yǎng)基加羊血bua+b厭氧培養(yǎng)某 加羊血buy酵母培養(yǎng) 基2%me2%的麥芽汁 提取物革蘭氏染色和菌落菌株形態(tài)觀察革蘭氏染色結 果革蘭氏陰性革蘭氏陽性厭氧菌酵母菌絲狀真菌確認實驗氧化酶反應 陽性氧化酶反應 陰性、三糖 鐵實驗a/a或k/a需在巧克力 培養(yǎng)基上或需要6.5%co2培養(yǎng)確認實驗氧化酶反應 陰性、三糖鐵 實驗k/k或k/aw微生物類型gn-nent 非

3、腸道菌gn-ent腸道菌gn-fas 苛生菌gp-coccus rod桿球 菌、gp-coccus 球菌、 gp-rod 桿 菌gp-rod(芽砲桿 菌)an 厭氧菌yt 酵母菌ff絲狀真菌擴大培養(yǎng)基bug+bbug+b巧克力培養(yǎng) 基bug+bbug+m+tbua+bbuy2%me培養(yǎng)溫度30 °c35-37°c35-37 °c35-37 °c30 °c35-37 °c26 °c26 °c培養(yǎng)氣體空氣空氣6.5% co2空氣或6.5%co2空氣無氫氣的厭 氧環(huán)境空氣空氣接種液類型gn/gp-ifgn/gp-if+t

4、gn/gp-if+tgn/gp-if+tgn/gp-ifan-if水ff-if接種濁度/ 濁度標準管52%t gn-nent61%tgn-ent20%t gp-coc &g p-rod &gnfas20%t gp-coc&g p-rod &gnfas28%tgp-rod sb65 %tan47%t yt75 %tff鑒定板類型/ 每孔菌懸液的 量gn2150 lugn2150 ulgn2150u1gp2150 ulgp2150u1an100 ulyt100 ulff100 ul培養(yǎng)時間(小 時)4-6,16-244-6,16-244-6,16-244-6,16-

5、244-6,16-2420-2424,48,7224,48,72,96第一步：在用戶自己的培養(yǎng)基上純化菌株，如果菌株為凍干或冷凍樣品，需要傳代培養(yǎng)23代，讓菌株恢復活力。 對純化好的菌株做革蘭氏染色，確定菌株是革蘭氏陰性還是陽性。觀察菌落外部形態(tài)或用顯微鏡觀察菌株 形態(tài)，確定是酵母還是絲狀真菌，是球菌還是桿菌。如果是革蘭氏陰性菌，還需耍最終確認是腸道菌、非腸道菌或苛生菌。方法是，氧化酶陽性或氧化酶陰性 但三糖鐵實驗為k/k或kav,則該菌株為非腸道菌(gn-nent),氧化酶陰性以及三糖鐵實驗為a/a或k/a,貝ij該 菌株為腸道菌(gnent)。如果菌株需要在巧克力培養(yǎng)基上或需要6.5% c

6、o2培養(yǎng)，在bug+b培養(yǎng)基上牛:長非 常差i形成針尖大小的菌落，那么可以認為這些菌是苛生菌(gn-fas)o大多數苛生菌都是從哺乳動物的呼吸道 里分禺出來的，女 wactmobacillus, alysiella, brucella, ca pn o cy top ha ga, cdc group df3, cdc group ef4, eikenella, haemophilus, kingella, moraxella, neisseria, simonsiella, suttonella, taylorella o如果是革蘭氏陽性菌，用革蘭氏染色可以很容易的區(qū)分球菌和桿菌，推薦再做一個

7、過氧化氫酶實驗，最終 確定是球菌還是桿菌。通過革蘭氏染色或觀察菌落形態(tài)可以區(qū)分出芽抱桿菌。微生物的擴大培養(yǎng)應該用biolog推薦的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以便使微生物達到最佳的代謝活性，進而準確的 和數據庫屮的代謝模式匹配。微牛物應該是新鮮的，確保其處于指數增長期，因為一些菌株在達到穩(wěn)定期吋會失去生存能力或代謝活性， 推薦的培養(yǎng)周期為424個小時。如果擴大培養(yǎng)的量不足以配制相應的濁度，可以培養(yǎng)多個平板，培養(yǎng)時間可以延長到48個小吋。 第二步：首先確定濁度儀沒開啟電源的時候，指針應指在0%,如果沒有，用螺絲刀調整。開啟電源，取未開蓋的裝 有接種液的試管，擦干凈管壁，放入濁度儀，指針應指在100%,如果

8、沒有，旋動右方旋鈕。然后用濁度標準管 檢驗，讀數在±2%都是正常的。要使用哪管接種液，就用相應的試管做100%校正，不要在濁度儀的光路中旋轉 試管。在鑒定革蘭氏陰性腸道菌和苛工菌的時候，在接種液里應該加準確三滴銃基乙酸鈉。毓基乙酸鈉的作用是 抑制芽抱形成，并且可以部分或完全的抑制a1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖莢膜而出現(xiàn)的紫色。 一些非腸道菌液需要添加疏基乙酸鈉。按照下列步驟制備均勻的菌懸液：用接種液將棉簽稍微浸濕，用棉簽在菌落上面輕輕的滾動可以將菌落取 到接種液中，從而不會將培養(yǎng)基或其它營養(yǎng)物質帶入接種液。先取單菌落，不夠再取生長緊密的菌落。在試管 內壁接種液液面的上方，

9、旋轉擠壓棉簽可以將菌落團分散。然后上下移動棉簽，將分散的菌落和接種液充分混 合形成均一，無菌團的菌懸液。如果菌懸液有菌團，可以讓菌團沉到管底。.調整濁度直至達到允許的范圍，增加接種液或添加菌落可以降低或升高菌懸液的密度。.將菌懸液接種到鑒定板上，不要超過20分鐘。如果長時間部接種到鑒定板上，一些菌會失去代謝活性。 第三步：.將鑒定板編上相應的號碼。把菌懸液倒入儲液槽，不要全部倒入，因為試管底部可能有未分散的菌團。按 照不同的鑒定板所需的加樣量進行移液器的程序選擇，將移液器頭安放到移液器上，必要時可以用手加固，以 免造成上方漏氣。吸取菌懸液，觀察每個移液器頭中的液面是否一致，如果不一致，放出菌懸

10、液，加固移液器 頭。加完菌懸液后，蓋上蓋子。第四步：培養(yǎng)環(huán)境根據所鑒定的菌株種類而定。準備一個塑料容器，在底部鋪上濕紙山，把鑒定板放在紙山上，可 以防止鑒定板外緣孔水分的蒸發(fā)。對于革蘭氏陰性陽性菌，鑒定板培養(yǎng)4-6個小時可以進行一次讀數，過夜培養(yǎng) （16-24個小時）可再進行一次讀數。厭氧菌在培養(yǎng)2024個小時后進行一次讀數即可。酵母和絲狀真菌所需培養(yǎng) 時間稍長，一般間隔24個小時讀一次數。第五步：開啟讀數儀和電腦，打開biolog軟件，并對讀數儀進行初始化，設置好各項參數（培養(yǎng)時間、菌株名稱、菌 株編號、菌株類型）,用紙巾擦干凈培養(yǎng)好的鑒定板底部，放入讀數儀，a1孔位于左上方。即可點擊&qu

11、ot;read this" 進行讀數。鑒定結果自動顯示在屏幕下方，將所得數據進行保存即可。四注意事項為了得到準確和可重復性的結果，務必注意下列事項。1. 所要進行鑒定的微生物必須是純種，此系統(tǒng)不是為在混合菌群中鑒定單一菌種而設計的。2. 在鑒定之前，選擇合適的培養(yǎng)基和進行適量的傳代培養(yǎng)是非常重要的。在接種之前，許多菌種會因為培養(yǎng)條 件的不同而產生不同的代謝模式。3. 在操作過程屮必須使用無菌器材和進行無菌操作，雜菌的污染會干擾結果。4. 大多數消耗品為一次使用，重復使用的如試管，移液器槍頭必須把去污劑清洗干凈。5. 在將菌懸液接種到鑒定板之前，應把鑒定板拿出冰箱，讓鑒定板恢復到常溫。

12、因為有些菌種（如neisseria ） 對溫度的快速變化很敏感。6. 仔細校正濁度計，接種菌懸液的濁度應在規(guī)定的范圍內。7. 鑒定板中包含多種對溫度和光照敏感的物質，如果個別孔出現(xiàn)棕黑色，說明碳源已經被降解。有時候，在保 質期內或超過保質期不長的時間里，個別孔會出現(xiàn)黃色或粉紅色，這是正常的。8. biolog是基于測試活菌的代謝特性。一些菌在很短的時間里會由于溫度、ph和滲透壓的壓力而喪失代謝活性。所以為了獲得良好的鑒定結果必須確保菌種為活菌，操作要小心。9. 為了延長鑒定板的保質期限，應在28°c的條件下避光保存。生態(tài)板(eco)一鑒定步驟%1 土壤樣品的采集，將土壤樣品加入到滅菌

13、水里接種。30 min后，用移液槍取1 nil污泥到1. 5nil離心管中。%1 在10 000 r / min下離心20 min,棄去上清液，加1 ml生理鹽水，在振蕩器上振動5 min使之混勻；再于10 000 r / min下離心20 min,重復2次，除去其中的碳源；棄去上清液，力口 1 ml生理鹽水，在振蕩器上振動5 min使之 混勻,于2 000 r/min下離心1 min。%1 取上清液倒人裝有20 nil已滅菌生理鹽水(nacl, 0. 85%)的試管中，并使其0d維持在0. 13±0. 02o%1 將上述稀釋液加入biolog eco微平板中，(150 l/孔)，然后在20°c下培養(yǎng)，每隔12 h用biolog細菌自動讀 數儀讀取數據，連續(xù)測定10 do二數據處理方法(采用sas統(tǒng)計軟件進行多樣性指數差異顯著分析和主成分分析)采用biolog微平板培養(yǎng)120h的數據進行數據統(tǒng)計，采用shannon指數shannon均勻度simpson指數mclniosh 指數和mclniosh均勻度各種多樣性指數來反映細菌群落代謝功能的多樣性。0b