【精品】植物活性多糖的分離、純化與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)四、植物活性多糖的分離、純化與鑒定第一部分多糖的提取、純化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、了解多糖提取和純化的一般方法。2、學(xué)習(xí)多糖的定量測(cè)定方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】多糖類物質(zhì)是除蛋白質(zhì)和核酸之外的又一類重要的生物大分子。早在60年代，人們就發(fā)現(xiàn)多糖復(fù)雜的生物活性和功能。多糖是普遍存 在于自然植物界中的由許多相同或不同的單糖以a 或b 糖昔鍵所組 成的化合物，其分子量一般為數(shù)萬甚至數(shù)百萬，是構(gòu)成生命活動(dòng)四大 基本物質(zhì)之一，與維持生命功能密切相關(guān)。大部分植物多糖不溶于冷 水，在熱水中呈粘液狀，遇乙醇能沉淀。多糖具有抗氧化性.抗病毒 性、反互補(bǔ)特性1,大量藥理及臨床研究表明，多糖類化合物是一種 免疫調(diào)節(jié)劑，它具有明

2、顯的抗補(bǔ)體活性和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用，能 激活免疫受體，提高機(jī)體的免疫功能，在用于癌癥的輔助治療中，具 有毒副作用小.安全性高、抑瘤效果好等優(yōu)點(diǎn)2。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)法（即水溶醇沉法）從植物組織中提取出水溶性粗多糖，對(duì)提取得到的多糖進(jìn)行分離純化，除去色素及小分子雜質(zhì), 并采用sevage法除蛋白。用蔥酮比色法測(cè)定多糖的含量。多糖的純化，就是將存在于粗多糖中的雜質(zhì)去除而獲得單一的多糖組分。一般是先脫除非多糖組分，再對(duì)多糖組分進(jìn)行分級(jí)。常用的 去除多糖中蛋白質(zhì)的方法有：sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸 法，這些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白質(zhì)沉淀，其中sev昭方 法脫蛋白效果較好，它是用氯仿：

3、戊醇或丁醇，以4： 1比例混合，加 到樣品中振搖，使樣品中的蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)，用離心法除去。本實(shí)驗(yàn)采用sev聘法（氯仿：正丁醇=4： 1混合搖勻）進(jìn)行脫蛋白,用deae 纖維素層析柱進(jìn)行純化，然后合并多糖高峰部分，濃縮后 透析，凍干，得多糖組分。多糖被濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫迅速水解，產(chǎn)生單糖，并迅速脫水生成醛糖衍生物，在這種強(qiáng)酸條件下與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物，該 衍生物在波長(zhǎng)490 nm處和一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與糖濃度呈線性關(guān)系，采用比色法對(duì)多糖含量進(jìn)行測(cè)定?！緦?shí)驗(yàn)試劑和器材】1 試劑活性炭、硫酸，5%苯酚溶液，葡萄糖，過氧化氫，乙酸鉛，丙酮，乙醇、無水乙醇na2hp04 12h20 na

4、h2p04 2h20 乙瞇o.olmol/l tris-hcl, ph=72。洗脫液：a: o.lmol nacl, 0.01 mol tris-hcl ph=7.2;0.5mol nacl, 0.01 mol tris-hcl ph=72。sevag試劑:氯仿：正丁醇=3：2 材料 香蕉皮粉末 市售香蕉的皮。3 器材 多功能粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋、deae-纖維素，離心機(jī)，透析袋、分光 光度計(jì)、層析柱(2. 5 x 30cm)【操作方法】一、粗多糖的提取 將香蕉皮切碎烘干后，粉碎過篩。稱取2g,采用熱水浸提法，每次原 料和水之比均為10,浸提溫度為80°c,浸提時(shí)間l5h,共提取4 次

5、，合并4次浸提液。濃縮一倍體積。對(duì)多糖提取液需進(jìn)行脫色處理, 即以1%的比例加入活性炭，攪拌均勻15min后過濾即可。在濃縮液 中加入3倍體積的95%乙醇攪拌,置冰箱24 h，沉淀為多糖和蛋白質(zhì)的混合物，此為粗多糖。它只是一種多糖的混合物，其中可能存在中性 多糖、酸性多糖、單糖、低聚糖、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，必須進(jìn)一步分離 純化。二、粗多糖的純化粗多糖溶液置于分液漏斗中，按照提取液體積的1/5量加入sevag試 劑（氯仿：正丁醇=3： 1混合搖勻），振蕩20 min, 3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下，離心15 min,得上清液測(cè)其體積，繼續(xù)加相應(yīng)體積的sevag試劑,并重復(fù)上述操作，直至氯仿層與正丁

6、醇層之間無乳白色變性蛋白質(zhì)析 出為止。收集上清液，加足量活性炭，搖勻，恒溫30min,過濾，得濾 液備用。將上述濾液倒入下端扎好的截流分子量為6 0008 000的半透膜袋中，將袋的另一端用繩扎好后，懸掛在盛有水的燒杯里，將燒杯放 在磁力攪拌器上，開動(dòng)攪拌，蒸憎水透析48 h,期間每2h更換一次水,經(jīng)常更換清水使透析膜內(nèi)溶液的濃度差加大，并加以攪拌，加快透析 速度，除去無機(jī)鹽、單糖、雙糖等小分子雜質(zhì)。加3倍體積95%乙醇 醇沉。沉淀放入冰箱干燥，獲得白色固體粉末，即得精制香蕉皮多糖。三、多糖的測(cè)定（苯酚硫酸法）1祥品溶液的制備精密稱取適量樣品，用蒸餛水溶解，定容至50 ml,即為待測(cè)樣液。2

7、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取105°c干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1 g,鼾 100 ml容量瓶中，溶解并稀釋至刻度，配成10 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，吸上述貯備 液1 ml定容至100 ml,配成0.1 mg/ml的工作液。精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 ml 于 25 ml 具塞 刻度試管中，加蒸餡水至2.0 ml,再各加5%苯酚溶液1.0ml搖勻,迅速加入濃h2so4溶液5 ml,5 min,放置10 min,置沸水浴中加熱20 min,取出冷卻至室溫，于490 nm,以試劑空白為參比測(cè)定吸光度。3 樣品

8、測(cè)定取2支試管各加入樣品溶液2ml,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，測(cè)定每只試管中反應(yīng)液的吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的多糖含量。并計(jì)算百分得率。三多糖條件的研究（一）單因素實(shí)驗(yàn)1 料液比的影響 準(zhǔn)確稱量一定量的香蕉皮粉五份，料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25和1:30,提取溫度為75°c,提取1次，時(shí)間為2h。按一、二中方法操作，測(cè)出吸光度。2 提取時(shí)間的影響料液比為1:20,提取溫度75°c,提取1次，每次提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5 和 2.0ho、二中方法操作，測(cè)出吸光度3 提取溫度的影響準(zhǔn)確稱取香蕉皮粉六份，料液比為1:20,分別在70、75、8

9、0、85、90和95°c條件下，提取1次，提取時(shí)間l.oho按照一、二中方法操作, 測(cè)出吸光度。4 提取次數(shù)的影響 在料液比為1:20,提取溫度為80°c條件下，分別提取1、2、3. 4次,每次提取時(shí)間為lh。按一、二中的步驟操作，測(cè)出吸光度。（二）提取條件的優(yōu)化在單因子條件探討的基礎(chǔ)上，制定因素水平表：考察四個(gè)因素（料液比、溫度、提取次數(shù)、每次提取時(shí)間），每個(gè)因素取三個(gè)水平（如溫度選擇75°c、0 °c和85 °c三個(gè)水平）。如表1。表1因素水平表因素a每次提取時(shí)間b溫度料液比d提取次數(shù)水平10.5751: 10221.0801： 15331

10、.5851： 204(h)(°c )(n)利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇正交表l9 （34）表研究香蕉皮多糖的最佳 提取條件。率試驗(yàn)號(hào)abc料液比d次數(shù)時(shí)間(h)溫度(°c )10.5751:15220.5801:20330.5851:25441.0751:20451.0801:25261.0851:15371.5751:25381.5801:15491.5851:202表2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析得吸光度 ()k2k3極差r最優(yōu)方案第二部分多糖的鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私獗訉游龇ǚ治鰡翁墙M分的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】采用薄層層析法分析單糖組分。薄層層析顯色后，比較多糖水解所得單糖斑點(diǎn)的顏色

11、和rf值與不同單糖標(biāo)樣參考斑點(diǎn)的顏色和rf值, 確定樣品多糖的單糖組分?！緦?shí)驗(yàn)試劑和器材】1 試劑硅膠、濃硫酸，氫氧化頓。展開劑:正丁醇:乙酸乙酯：異丙醇：醋酸:乙醇:水:毗喘=7： 20：12： 7： 6： 6o顯色劑：1, 3二輕基蔡硫酸溶液（0.2%1, 3二輕基秦乙醇溶液）:濃硫酸=1： 0.04 (v/v) o單糖標(biāo)準(zhǔn)品。2器材烘箱、玻璃板【實(shí)驗(yàn)操作】、單糖組分分析1.薄層板制備：稱取硅膠5g于50ml燒杯中，加入用12 ml 0.3mo 1/l磷酸二氫鈉水溶液，用玻璃棒慢慢攪拌至硅膠分散均勻，鋪在玻璃板上（7scmxlocm）, 110°c活化lh。即置有干燥劑的干燥箱中備用。2.點(diǎn)樣：稱取少許的多糖（01克）于2. oml離心管中，加入1m的硫酸iml,沸水浴水解2h,然后加氫氧化頓中和至中性，過濾除去硫 酸鍥沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行點(diǎn)樣進(jìn) 行薄層層析展開。用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線 距底邊2.0cm,點(diǎn)樣直徑為24mm,點(diǎn)間距離約為1.52.0cm,點(diǎn) 間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷 薄層表面。3展開：展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展