畢業(yè)設(shè)計：酸棗酚類化合物的高效液相色譜測定及其抗氧化作用的研究(終稿)-精品

1、I酸棗酚類化合物的高效液相色譜測定及其抗氧化作用的研究（西北大學(xué) 化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系 西安 710069）摘要：本文以 3 種不同溶劑酸棗提取物為研究對象，建立了一種測定酸棗酚類化合物的HPLC-ECD 分析方法以及在測定其提取物中總酚酸和總黃酮含量的基礎(chǔ)上，利用體外法測定各提取物的還原能力、對 Fe2+的絡(luò)合能力、對 DPPH 自由基的清除作用及對羥基自由基的清除作用。實驗結(jié)果表明，酸棗中含有沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、楊梅酮、高良姜素、山奈酚等十種酚酸。3 種不同溶劑酸棗提取物均有顯著的抗氧化性，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，酚酸含量、還原能力、抗氧化能力之間呈正

2、相關(guān)。關(guān)鍵詞：酸棗；酚類化合物；高效液相色譜；抗氧化Jujube phenolic compounds by HPLC and its antioxidant research (Northwest University, College of Chemical Engineering, Food Science & Technology, Xian 710069)Abstract: In this paper, three kinds of extracts in different solvents axillaris study, the establishment of a d

3、etermination of phenolic compounds in jujube HPLC-ECD method and measured the total phenolic extract and total flavonoids based on the in vitro method The ability to extract the reduction of Fe2+complexation ability of the DPPH free radical scavenging and scavenging of hydroxyl radicals. Experimenta

4、l results show that the jujube contains gallic acid, protocatechuic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, rutin, quercetin, myricetin, galangin, kaempferol and ten other acids. 3 different solvents jujube extract showed a significant antioxidant activity in a dose-response relationship,

5、 phenolic content, reducing power, antioxidant capacity were positively correlated.Key words: Jujube; phenolic compounds; HPLC; antioxidant目 錄 摘要 AbstractII第一章 緒論.11.1 酚酸類化合物.11.2 黃酮類化合物.11.3 高效液相色譜檢測器.21.3.1 電化學(xué)檢測器.21.4 高效液相色譜法在酚酸和黃酮化合物中的應(yīng)用.21.4.1 高效液相色譜法在酚酸和黃酮化合物檢測中的應(yīng)用.31.4.2 高效液相色譜法在酚酸和黃酮類化合物抗氧化活

6、性研究中的應(yīng)用.31.5 本論文研究的內(nèi)容.3參考文獻:.4第二章 酸棗提取物的 HPLC-ECD 法測定.82.1 材料與方法.82.1.1 儀器及試劑.82.1.2 溶液配制.82.1.3 色譜條件.92.2 結(jié)果與分析.92.2.1 色譜條件的優(yōu)化.92.2.2 線性關(guān)系考察.102.2.3 精密度實驗.112.2.4 穩(wěn)定性實驗.112.2.5 重復(fù)性實驗.112.2.6 樣品的測定.112.3 結(jié) 論.12參考文獻：.12第三章第三章 酸棗提取物酸棗提取物抗抗氧化活性的研究氧化活性的研究.143.1 材料與方法.143.1.1 材料.143.1.2 試劑.143.1.3 主要儀器設(shè)備

7、.143.2 實驗方法.143.2.1 酸棗提取物制備方法.153.2.2 不同溶劑提取的酸棗的總酚含量測定方法.153.2.3 不同溶劑提取的酸棗的總黃酮含量測定方法.153.2.4 不同溶劑提取的酸棗對 Fe3+的還原能力測定5.153.2.5 不同溶劑提取的酸棗對 Fe2+絡(luò)合能力的測定6.163.2.6 不同溶劑提取的酸棗對 DPPH 自由基的清除實驗.163.2.7 不同溶劑提取的酸棗對羥基自由基的清除實驗.163.3 結(jié)果與分析.173.3.1 酸棗的提取率.173.3.2 酸棗的總酚含量.173.3.3 酸棗的總黃酮含量.173.3.4 酸棗不同溶劑提取物對 Fe3+的還原能力.

8、183.3.5 酸棗提取物對 Fe2+的絡(luò)合能力.193.3.6 酸棗提取物對 DPPH 自由基的清除.193.3.7 酸棗提取物對羥基自由基的清除.203.4 結(jié)論.20參考文獻：.201第一章 緒論酚類化合物是廣泛分布于植物之中的一類復(fù)雜的化合物，是人類食物中一種普遍存在組分。酚類化合物包括酚酸、黃酮和其它化合物。其中，酚酸和黃酮均具有顯著的生理和藥理活性，對一些常見病、多發(fā)病有重要的生理作用。近年來，酚酸和黃酮類化合物的分析方法研究得到了迅速的發(fā)展。本章簡單介紹了酚酸和黃酮類化合物，綜述了高效液相色譜法在研究天然產(chǎn)物抗氧化成分中的應(yīng)用情況。1.1 酚酸類化合物 酚酸類化合物包括阿魏酸、咖

9、啡酸、棕櫚酸、香草酸等。阿魏酸，化學(xué)名為 4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸。在醫(yī)學(xué)上，阿魏酸有廣泛用途,其毒性極低, 具有抗炎、止痛、抗血栓形成、抗紫外線輻射、抗自由基以及調(diào)節(jié)人體免疫功能的作用，在臨床上用于冠心病、腦血管病、脈管炎、白細胞和血小板減少等疾病的治療。在化妝品中主要作為抗氧化劑使用，具有吸收紫外線和防止氧化的作用, 被認為是最好的天然防曬劑。酚酸類化合物具有多種生理及保健功能，主要表現(xiàn)在：清除體內(nèi)自由基、舒張血管、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌、消炎、抗癌細胞血管阻斷素、刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體、抑制磷脂酶、脂肪氧化酶、環(huán)加氧酶、黃嘌呤氧化酶等酶的活性1-5。酚酸類化合物可以分為以下幾類6：

10、羥基苯甲酸(C6- C1)的羥基化衍生物，這類化合物除了被酯、配糖取代外，大多以游離態(tài)存在，常見的如沒食子酸；苯乙酮、苯乙酸(C6- C2)的衍生物；苯乙烯酸、香豆素、異香豆素(C6-C3)的衍生物，這類酚酸化合物常常被酯化很少以游離態(tài)存在，例如：咖啡酸、阿魏酸、香豆酸等。1.2 黃酮類化合物黃酮類化合物是指具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)特點的一類酚類化合物。黃酮類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，是植物長期自然選擇過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。黃酮類化合物對人類健康有重要作用，并且具有特殊的生物效能。是一種自由基清除劑，對過敏、感染、高血壓和腫瘤等疾病具有輔助治療等作用7-12。根據(jù)C3部分成環(huán)、氧化和取代方

11、式的差別，黃酮類化合物可分為黃酮醇、黃烷酮、異黃酮、黃烷醇、黃烷酮醇、查耳酮和花色素等13。酚酸和黃酮類化合物的酚羥基是優(yōu)良的氫或中子給予體，對能引起DNA、蛋白質(zhì)或生物組織膜及各種細胞器因產(chǎn)生過氧化作用而導(dǎo)致生物體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的各種損傷的過氧化自由基、羥基自由基等有明顯的清除作用，從而保護了各器官的細胞2結(jié)構(gòu)14-17。由于它特殊的生理作用，研究酚酸和黃酮類化合物的高效液相色譜法具有十分重要的意義。1.3 高效液相色譜檢測器 高效液相色譜（HPLC)是20世紀60年代后，在經(jīng)典液相色譜-柱色譜的理論基礎(chǔ)上加以改進而發(fā)展起來的新型高效分離分析技術(shù)。HPLC將分離和分析有機

12、的結(jié)合起來，實現(xiàn)了對復(fù)雜體系中組分、價態(tài)或化學(xué)性質(zhì)相近的元素或化合物的快速分析。HPLC由于具有分離效率高、分析速度快和應(yīng)用范圍廣等特點，已經(jīng)成為藥品分析，食品衛(wèi)生，商品檢驗，環(huán)境檢測，化學(xué)化工等領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)18-23 。1.3.1 電化學(xué)檢測器 電化學(xué)檢測是根據(jù)電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進行檢測的。電化學(xué)檢測器主要有安培、極譜、庫侖和電導(dǎo)檢測器四種。前三種統(tǒng)稱為伏安檢測器，以測量電解電流的大小為基礎(chǔ)，后者則以測量液體的電阻變化為根據(jù)。其中，安培檢測器的應(yīng)用最為廣泛。 安培檢測器是在外加電壓的作用下，利用待測物質(zhì)在電極表面上發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流的變化而進行測定的一種方法。安培

13、檢測器具有如下優(yōu)點24：靈敏度高。僅有110的被測定的電活性物質(zhì)得到轉(zhuǎn)化，但檢出限可達10-910-12g，而且對各類電活性物質(zhì)靈敏度差別很小；選擇性高。一般只對電活性物質(zhì)有響應(yīng)，適用于電活性物質(zhì)的痕量測量，而不受非電活性物質(zhì)的干擾。由于每種物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)的電位不同，對于具有不同電極電位的物質(zhì)，只要在電解池的兩極間施加不同的電壓，就可以控制電極反應(yīng)，提高選擇性；線性范圍寬。一般線性范圍可達45個數(shù)量級，對某些體系線性范圍甚至可達到6個數(shù)量級；結(jié)構(gòu)簡單。不需要紫外可見光檢測器的光學(xué)元件，造價和使用成本都很低；檢測池體積小，柱外效應(yīng)較小，噪聲低，響應(yīng)速度快。根據(jù)電化學(xué)檢測器的工作原理，原則上凡

14、是具有電活性的化合物都可以用安培檢測器來檢測。目前，液相色譜電化學(xué)檢測器已在活體代謝分析、臨床化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、食品衛(wèi)生的檢查和環(huán)境等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。采用衍生化技術(shù)，還可將它擴展到非電活性物質(zhì)的檢測。金利通等25-26通過在流動相中添加抗壞血酸，成功的用于測定異丙醇、異丁醇、叔丁醇和戊醇及甲酸甲酯、甲酸乙酯等非電化學(xué)活性的化合物。Watabe等27用分子印記聚合體作為樣品前處理裝置，液相色譜-電化學(xué)測定了水體中痕量激素雙酚A，靈敏度高，檢測速度快。近幾年，隨著新檢測池28、新的修飾電極29-32的不斷引入，液相色譜-電化學(xué)檢測的研究領(lǐng)域?qū)⑦M一步被擴展。1.4 高效液相色譜法在酚酸和黃酮化合物

15、中的應(yīng)用31.4.1 高效液相色譜法在酚酸和黃酮化合物檢測中的應(yīng)用酚酸和黃酮類化合物是一類重要的有機化合物，它們的酚羥基是優(yōu)良的氫或中子的給予體，對能引起DNA、蛋白質(zhì)或生物組織膜及各種細胞器因產(chǎn)生過氧化作用而導(dǎo)致生物體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的各種損傷的過氧化自由基、羥基自由基等有明顯的清除作用，從而保護了各器官的細胞結(jié)8,9,33,34 。由于它特殊的生理作用，研究酚酸和黃酮類化合物的各種測定方法具有十分重要的意義。1.4.2 高效液相色譜法在酚酸和黃酮類化合物抗氧化活性研究中的應(yīng)用 酚酸和黃酮類化合物是一類天然的抗氧化劑，評價其抗氧化能力方法的研究已被廣泛的關(guān)注。DPPH自由基

16、法和ABTS+法可直接用于評價植物提取物抗氧化能力，其原理是：當(dāng)抗氧化劑與自由基發(fā)生反應(yīng)后，反應(yīng)體系的顏色發(fā)生變化。通過測定吸光度的變化來評價抗氧化劑清除自由基的能力。采用光度計僅能夠評價樣品的總抗氧化能力35。另外，利用一些反應(yīng)(例如Fenton反應(yīng))也可以評價植物提取物的抗氧化能力，其原理是：利用抗氧化劑與捕獲劑同時與自由基競爭反應(yīng)，通過捕獲劑反應(yīng)前后量的變化可以評價樣品的總抗氧化能力36。近年來，利用高效液相色譜法集分離和檢測于一體的特性，將高效液相色譜法應(yīng)用于抗氧化的研究中，不僅能夠快速識別復(fù)雜混合物中抗氧化成分，而且可以用于定量評價復(fù)雜混合物中單組分的抗氧化能力。郭華等37利用HPL

17、C-DAD技術(shù)，以苯甲酸作為羥基自由基捕獲劑，根據(jù)加入中草藥提取液前后苯甲酸改變量，從而間接測定了中草藥提取液對羥基自由基的清除率。Koleva等38采用DPPH穩(wěn)定自由基在線測定了復(fù)雜混合物中的單個抗氧化劑，表明在線法是一種快速、高通量篩選抗氧化劑的方法。Shui等39利用HPLC-DAD-ESI/MS聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合紅外光譜和核磁共振譜，從黃秋葵植物提取物中鑒定出四種具有抗氧化活性的槲皮素糖苷類化合物。Wu等40采用HPLC-UV從菊科植物中鑒定出兩種具有抗氧化活性的黃酮類化合物。1.5 本論文研究的內(nèi)容 在本章中，簡單介紹了酚酸和黃酮類化合物，綜述了高效液相色譜檢測器-電化學(xué)檢測器及高效液

18、相色譜法在酚酸和黃酮類化合物研究中的應(yīng)用情況。在第二章中，建立了同時測定酸棗提取物中沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、楊梅酮、高良姜素、山奈酚10種酚類化合物含量的HPLC-ECD法。在第三章中，在測定其提取物中總酚酸和總黃酮含量的基礎(chǔ)上，利用體外性法測定各提4取物的還原能力、對Fe2+的絡(luò)合能力、對DPPH自由基的清除作用及對羥基自由基的清除作用。參考文獻:1.Roberta M.,Roberta D.B.,Rosaria V.,et al.,Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biologic

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39、istry,2006,96:220-227.8第二章 酸棗提取物的 HPLC-ECD 法測定 酸棗為鼠李科棗屬(Ziziphus)植物，在我國分布廣泛1-2，有著很高的營養(yǎng)和食療價值3-4 ，富含糖、蛋白質(zhì)、有機酸、維生素和多種酚類化合物5。酸棗仁是中醫(yī)常用的寧心安神藥，酸棗果實具有止血、止瀉等功效6。有研究表明，酸棗具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥7、降壓、降血脂等8,9作用。近年來，英國學(xué)者在對虛弱癥患者的觀察中發(fā)現(xiàn)，凡是連續(xù)按時吃酸棗的，其康復(fù)速度比單純服用多種維生素類的快 6 倍以上。因此，酸棗被證明具有防病、抗衰老與養(yǎng)顏益壽的作用，這些都與酸棗中富含多酚類等抗氧化物質(zhì)有關(guān)。 目前，國內(nèi)外對酚酸類化合

40、物的分離檢測方法有比色法10、高效液相色譜法11和毛細管電泳法12等。高效液相色譜法具有簡便、快速，回收率好，精密度高等優(yōu)點。電化學(xué)檢測器由于具有選擇性好、靈敏度高以及響應(yīng)迅速等特點，在分析電活性物質(zhì)時具有不可替代的優(yōu)勢。 本文采用高效液相色譜-電化學(xué)法，對 3 種不同溶劑提取的酸棗化合物中沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、楊梅酮、高良姜素、山奈酚 10 種酚類化合物進行直接的測定，為揭示酸棗的保健功能和抗氧化活性提供依據(jù)。2.1 材料與方法2.1.1 儀器及試劑HP1100 高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司），包括四元梯度泵 （G1311A），二極管陣列

41、檢測器（G1315A）和電化學(xué)檢測器（1049A）；色譜數(shù)據(jù)通過 HP 工作站采集和獲得；Milli QG 超純水制備儀（美國 Millipore 公司）；DL-180 超聲清洗器（浙江省象山縣石浦天電子儀器廠）。酸棗：分別用水、甲醇、丙酮提取，最后用 80%乙醇配制為 8 mgmL-1酸棗液。沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、楊梅酮、高良姜素、山奈酚對照品（純度98%）均購于 sigma 公司。甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，所用水為超純水。2.1.2 溶液配制對照品溶液：準確稱取對照品適量，分別置于 10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，振蕩均勻后即可得沒食子酸（

42、0.40 mgmL-1）、原兒茶酸（0.42 mgmL-1）、咖啡酸（0.36 mgmL-1）、p-香豆酸（0.30 mgmL-1）、阿魏酸（0.35 mgmL-1）、蘆?。?.42 mgmL-1）、楊梅酮（0.06 mgmL-1）、槲皮素（0.33 mgmL-1）、山奈酚（0.30 mgmL-1）、高良姜素9（0.30 mgmL-1）的單一對照品儲備液。其他不同濃度的各對照品溶液由儲備液稀釋得到。2.1.3 色譜條件美國 Zorbax SB-C18 (150 mm 416 mm，5.0 m) 色譜柱；流動相為甲醇-2%的醋酸；梯度洗脫，其時間程序為 0 10 15 25 30 35min，甲

43、醇體積分數(shù)相應(yīng)為 5% 20% 40% 60% 70% 70%；流速為 1.0 mLmin-1；電化學(xué)檢測器（ECD）：安培檢測電位為 0.8 V；柱溫為 30 ；檢測波長為 360 nm。沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、楊梅酮、槲皮素、山奈酚、高良姜素的保留時間分別為3.346、5.977、12.623、16.185、17.105、18.968、20.300、23.355、36.147、31.83。2.2 結(jié)果與分析2.2.1 色譜條件的優(yōu)化由于各組分極性相差較大，故采用梯度洗脫，先后嘗試了不同比例的流動相體系，對色譜條件進行了優(yōu)化。酚類化合物屬于有機酚酸，易解離，因而

44、常常導(dǎo)致色譜峰出現(xiàn)拖尾、變寬和不對稱現(xiàn)象。這是由于酚羥基的解離，使其在固定相表面有雙重保留機制。在流動相中加入酸性抑制劑可使酚羥基的解離被抑制，在反相色譜條件下，成為中性疏水締合物，使分離效果和峰形得到改善13。本實驗選定甲醇-2%醋酸水溶液體系作為流動相。結(jié)果表明：在本文所確定的色譜條件下，酸棗中的多酚化合物得到最佳的分離效果，如圖 1 所示。圖圖 1 10 種酚類化合物的種酚類化合物的 HPLC-ECD 色譜圖色譜圖05101520253035050100150200250response/nATime/min1 12 23 34 45 56 67 78 89 91 10 0 1. 沒食子

45、酸 2. 原兒茶酸 3. 咖啡酸 4. p-香豆酸 5. 阿魏酸6. 蘆丁 7. 楊梅酮 8. 槲皮素 9. 山奈酚 10. 高良姜素1005101520253035020406080100120140response/nATime/min1 12 23 34 46 67 78 89 91 10 0a05101520253035010203040506070response/nATime/min1 12 23 34 45 56 67 78 89 91 10 0b05101520253035020406080100120140160response/nATime/min1 12 23 34 46

46、 68 81 10 0c 05101520253035020406080100120140160180response/nATime/min1 12 23 34 46 67 78 81 10 0d圖圖 2 酸棗提取物的酸棗提取物的 HPLC-ECD 色譜圖色譜圖 1. 沒食子酸 2. 原兒茶酸 3. 咖啡酸 4. p-香豆酸 5. 阿魏酸6. 蘆丁 7. 楊梅酮 8. 槲皮素 9. 山奈酚 10. 高良姜素 a 酸棗水提取物的 HPLC-ECD 色譜圖 b 酸棗水提取物加標的 HPLC-ECD 色譜圖c 酸棗甲醇提取物的 HPLC-ECD 色譜圖d 酸棗丙酮提取物的 HPLC-ECD 色譜圖2

47、.2.2 線性關(guān)系考察準確移取沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、楊梅酮、槲皮素、山奈酚、高良姜素儲備液適量分別置于 10ml 容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，振蕩均勻，作為對照品稀釋液。在同一色譜條件下分別進對照品稀釋液 10.0 l，確定標準物質(zhì)的保留時間。11然后各取一定體積儲備液配成一系列不同濃度的混合標準溶液，分別平行測定 3 次(進樣量均為 10.0 l)，以平均峰面積 Y 對進樣量 X(g/ml)進行線性回歸，按空白測定的平均噪聲 3倍計算檢出限，各物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表 1。 表 1 10 種多酚化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限(n=3

48、)酚酸種類保留時間（min）線性范圍（g/ml）回歸方程相關(guān)系數(shù)檢出限定量限沒食子酸原兒茶酸咖啡酸p-香豆酸阿魏酸蘆丁楊梅酮槲皮素山奈酚高良姜素3.3465.97712.62316.18517.10518.96820.30023.35536.14731.830.0780.2500.0554.3750.0947.5000.0786.2500.0947.5003.500280.00.12510.00.0866.8750.0786.2500.0786.250y=379.28x+21.366y=545.43x +4.9696y=513.57x + 4.1373y=701.06x + 12.744y=4

49、17.87x 43.334y=11.343x + 43.422y= 219.73x 26.796y=435.78x 13.123y=278.06x 28.766y=320.33x 8.77660.99930.99920.99920.99930.99930.99940.99920.99980.99930.99930.00450.00310.00380.00160.00300.09160.00740.00320.00560.00340.01500.01050.01270.00550.01010.30540.02470.01060.01880.01142.2.3 精密度實驗精密吸取酸棗提取物供試品溶

50、液 10.0 l，重復(fù)進樣 6 次，進行測定。結(jié)果表明，沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、楊梅酮、槲皮素、山奈酚、高良姜素10 種酚類化合物的峰面積積分值的 RSD 分別為 1.3% 1.7%之間。2.2.4 穩(wěn)定性實驗對酸棗提取物溶液在 8h 之內(nèi)每隔 1 h 進行考察，結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、楊梅酮、槲皮素、山奈酚、高良姜素峰面積積分值的 RSD 分別為 1.4%1.7%之間 (n=9)。2.2.5 重復(fù)性實驗精密稱量酸棗提取物 2.0 g 共 6 份，按 1.2 制備供試品溶液后，進行測定。結(jié)果表明，沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、p-香

51、豆酸、阿魏酸、蘆丁、楊梅酮、槲皮素、山奈酚、高良姜素含量的 RSD 分別為 1.6%1.9% 之間。2.2.6 樣品的測定12將 3 個酸棗提取物按照 1.2 中的方法制備供試品溶液，進樣 10.0l 進行測定，用回歸方程計算含量。結(jié)果見表 2。表 2 樣品的測定結(jié)果 (g/g)樣品沒食子酸 酚酸種類（g/g）原兒茶酸 咖啡酸p-香豆酸阿魏酸水提取甲醇提取丙酮提取40.172048.051143.845076.795166.6496167.494018.72479.013420.5255NDND5.3014NDNDND蘆丁 楊梅酮 槲皮素 山奈酚 高良姜素水提取甲醇提取丙酮提取278.9010

52、286.9810871.516068.8197ND30.883850.838515.454015.437727.9469NDND35.1397ND23.84972.3 結(jié) 論本文采用高效液相色譜電化學(xué)檢測法，從酸棗中檢測出 10 種有生物活性的酚化合物。從表 2 可以看出，不同提取物樣品中 10 種酚化合物的含量存在差異，其中蘆丁，沒食子酸和原兒茶酸，是酸棗主要酚類化合物。本實驗所建立的高效液相色譜分析方法使被測化合物均得到了基線分離，方法具有準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好等特點，為酸棗抗氧化研究和酸棗產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。參考文獻：1.高敬東，楊廷楨，梁芊等野生酸棗資源的開發(fā)利用現(xiàn)狀及發(fā)展建議J.山西果

53、樹，2003(5)：29-30.2.周永紅,王立升,李偉光酸棗仁油理化特性及脂肪酸組成分析J糧食與油脂，2005，30(9)：68-69.3.許洛,楊志孝，趙福歧泰山全蝎、瓜菱、酸棗仁中微量元素測定J.微量元素,1988(1)：52-53.4.吳樹勛,李蘭芳.酸棗的營養(yǎng)成分與營養(yǎng)實驗研究J.河北醫(yī)藥, 1990(1): 3-4.5.王向紅，崔同，劉孟軍.不同品種棗的營養(yǎng)成分分析J營養(yǎng)學(xué)報，2002(5)：24-26.6.劉仕云，黃艷嵐，張樹珍.植物花青素合成中的調(diào)控基因J植物生理學(xué)通訊，2006，42(4)：747-754137.WU X L,PRIOR R.Systematic identi

54、fication and characterization of anthocyanins by HPLC2ESI2MS/MS in common fosds in the United States:Fruits and berries J.Journal of Agriculture and Food Chemistry,2005,53(7):2589-25998.陸國權(quán),唐忠厚.腳板薯花青素提取及其純化技術(shù)研究J.食品工業(yè)科技,2005,26(11):131-1359.董怡,林松毅,劉艷豐等.RP-HPLC法優(yōu)化篤斯越橘花青素提取、純化技術(shù)研究J食品科學(xué),2008,29(10):349-

55、35210. Shui G.H.,Peng L.L.,Journal of Chromatography AJ,2004,1048:17-2411. CAO Wei(曹煒),YU Ya-Hui(尉亞輝),GUO Bin(郭斌).Acta Photonica Sinica(光子學(xué)報) J,2002,31(12):162-16412. VillanoD.,Fernandez-PachonM.S.,MoyaML,et al.TalantaJ,2007,7l(1):230-23513. 索志榮,曹煒,秦海燕.蜂膠浸膏中 7 種多酚化合物的高效液相色譜法分析J.食品科學(xué), 2008, 29 (8): 4

56、96-498.14第三章第三章 酸棗提取物抗氧化活性的研究酸棗提取物抗氧化活性的研究自由基生物學(xué)研究認為，許多疾病與自由基導(dǎo)致的生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA 氧化損傷有關(guān)，尤其是活性氧如超氧陰離子自由基、羥基自由基、脂質(zhì)自由基可以引起心腦血管，衰老、癌癥等疾病 1。天然抗氧化劑如酚性化合物（包括黃酮類化合物、酚酸、生育酚等）對自由基有很強的清除作用，其主要機理是這些化合物能夠提供質(zhì)子氫，阻斷自由基導(dǎo)致的鏈式反應(yīng)，另外酚性化合物還能夠通過絡(luò)合過度金屬如亞鐵離子，以阻斷亞鐵離子介導(dǎo)的自由基鏈式反應(yīng)2。體內(nèi)氧自由基代謝失衡與多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切，黃酮類成分和多酚類成分具有很好的抗炎和抗氧化作

57、用,它們能夠抑制體內(nèi)自由基的產(chǎn)生,減少組織損傷程度,并且通過抑制免疫細胞釋放炎癥因子和細胞因子達到緩解炎癥的作用。臨床調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，食用富含黃酮、酚酸類化合物的水果和蔬菜能降低一些與體內(nèi)自由基代謝失衡的有關(guān)疾病發(fā)生。酸棗中酚酸和黃酮含量較其他水果高，富含糖、蛋白質(zhì)、有機酸、維生素和多種酚類化合物。因此，對酸棗酚類化合物的抗氧化作用的研究對以后酸棗開發(fā)利用有著重要的意義。3.1 材料與方法3.1.1 材料酸棗：采自陜西省榆林市。3.1.2 試劑1,1 苯基-2-苦肼基自由基（DPPH） 、Ferrozine 鐵試劑、2-脫氧核糖和二丁基羥甲基苯（BHT）購自 sigma 公司。無水甲醇、無水丙酮

58、、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、沒食子酸、蘆丁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水碳酸鈉、硫酸亞鐵、EDTANa2、抗壞血酸、EDTA、過氧化氫和硫代巴比妥酸均為國產(chǎn)分析純試劑。3.1.3 主要儀器設(shè)備 UV751-GWD紫外/可見分光光度計(上海分析儀器總廠)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ-l00B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-1型真空干燥箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司) ；D-9143B-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司)；電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)

59、；FD-1冷凍干燥機(北京博醫(yī)康技術(shù)公司)。153.2 實驗方法3.2.1 酸棗提取物制備方法 取酸棗若干，清洗去核并將肉皮烘干磨成粉末, 準確稱取酸棗果肉粉 10.0g 于 250mL 平底燒瓶中，用 150ml 蒸餾水、100%甲醇，100%丙酮加熱回流 2h，離心分離，取出上清液。殘渣溶解再提取 1h，合并兩次提取液，濃縮，冷凍干燥得不同溶劑的酸棗果肉提取物。稱取不同提取物 0. 2g，用蒸餾水超聲溶解并定容至 100mL，配制成 2mg/mL 的溶液，置于-4冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2 不同溶劑提取的酸棗的總酚含量測定方法 （1）標準曲線的繪制:準確稱取 5mg 沒食子酸，用蒸餾水溶解

60、，配制成 01mg/mL 的對照品溶液。取 7 支 25mL 具塞刻度試管，分別移取 0.0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL 沒食子酸對照品溶液于試管中，加入 1mLFolin-Ciocalteu 顯色劑，然后各試管中加入 5mL lmol/L 的碳酸鈉水溶液，用蒸餾水定容至 10mL，混合均勻后，在室溫下避光放置 1h，用lcm 的比色管在 760nm 處測定吸光值。以對照品溶液的吸光值和對照品的質(zhì)量(nlg)進行線性回歸，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。（2）酚酸含量的測定采用 Folin-Ciocalteu 法3（用沒食子酸作標準物） 。準確移取 2mg /ml 對應(yīng)提取溶劑的各待測