蛋白質(zhì)測定實(shí)驗(yàn)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名： xxx 學(xué) 號(hào)： xxxxxxxxxx 專業(yè)年級： xxxxxxxx 組 別： xxx 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)合作者指導(dǎo)老師評分教師簽名批改日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理 及其實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。2、掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 求樣品溶液中待測定物質(zhì)含量的方法 。二、實(shí)驗(yàn)原理1921年，F(xiàn)olin 首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。1951年，Lowry對此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提

2、高了靈敏度。第一步：雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOCNHCONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè)肽鍵, 因此有雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物。第二步：Folin-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此顯色反應(yīng)。即蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷

3、鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。三、材料與方法：材料 1、樣品: 健康人血清（300倍稀釋） 正常人血清蛋白質(zhì)含量：6080 g/L2、試劑 : 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200g/mL） 堿性硫酸銅溶液（當(dāng)日有效） Folin-酚試劑3、儀器與器材 : V-1100分光光度計(jì) 恒溫水浴箱 試管6支、試管架 加樣槍、加樣槍架 坐標(biāo)紙方法蛋白樣品堿性銅試劑混勻10min加酚試劑2S混勻水浴10min放至室溫比色 Folin-酚試劑法定量蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)具體步驟

4、步驟操作（1）反應(yīng)體系設(shè)置取6支試管，按下表加入試劑，混勻空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 樣品管試劑 1 2 3 4 5 6牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 -樣品液 - - - - - 0.5蒸餾水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5（2）雙縮脲反應(yīng)向各管內(nèi)分別加入堿性硫酸銅溶液2ml，混勻，室溫放置10min（3）Folin-酚試劑反應(yīng)再加入Folin-酚試劑0.20ml，2s內(nèi)迅速混勻。40攝氏度水浴10min后，冷卻至室溫（4）比色測定以500nm波長比色，用1號(hào)管作空白，讀取各管吸光度值A(chǔ)500注意事項(xiàng)Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件

5、下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。即第1支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mL Folin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mL Folin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。水浴10min，冷卻后，每一分鐘測一管

6、。四、結(jié)果與討論：1、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 加入牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品液、蒸餾水的過程中混合溶液一直為無色透明溶液，且?guī)缀鯚o明顯變化。待加入Folin-酚試劑之后，水浴10min，2-6號(hào)試管溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)色，而且2-5號(hào)試管溶液顏色逐漸加深，而1號(hào)試管溶液仍無明顯變化。2、數(shù)據(jù)記錄 按照表格記錄各管在500nm波長測得的吸光度值各 管 A 值測定次數(shù)23456123各管平均值A(chǔ)5000.0240.0570.0730.1020.0840.0250.0220.0590.0580.0730.0970.0830.0710.1000.0850.02370.05800.07230.09970.08403、根據(jù)實(shí)驗(yàn)

7、數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)值曲線，如下圖4、結(jié)果計(jì)算根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量=（0.0840-0.0011）/0.0006=138.167(g/mL)然后乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(g/mL)。最后濃度單位換算成 g/L血清蛋白濃度(g/mL)=樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300=138.17×2×30082900g/mL=82.9g/L5、結(jié)果分析在本次試驗(yàn)中，我們組按照授課老師的指示，積極完成實(shí)驗(yàn)。但在實(shí)驗(yàn)過程中，由于一些操作不當(dāng)，

8、也導(dǎo)致了本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)一些偏差。例如，在用移液管添加蒸餾水的時(shí)候，缺乏謹(jǐn)慎的態(tài)度，導(dǎo)致部分蒸餾水濺出桌面。還有在用加樣槍添加牛血清蛋白溶液、樣品溶液的時(shí)候存在加樣槍未排凈空氣便吸入溶液的現(xiàn)象，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。但是相對與其他小組的實(shí)驗(yàn)，我們組的確存在一些優(yōu)勢。比如，有個(gè)別組在加入Folin-酚試劑后溶液，這是因?yàn)樗麄兗尤隖olin-酚試劑后沒有及時(shí)混勻或加入Folin-酚試劑的量偏多；還有個(gè)別組水浴后的溶液呈現(xiàn)無色，這是因?yàn)镕olin-酚試劑在反應(yīng)前就已經(jīng)被破壞，被破壞的原因也是加入Folin-酚試劑后沒有及時(shí)混勻，或者是水浴時(shí)間過長。而我們組操作相對較規(guī)范，很好的避免了這樣的問題。五、課后思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？ Folin-酚試劑的優(yōu)點(diǎn)有：靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍。 操作簡單，不需特殊儀器設(shè)備。2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？ 此法是在Folin-酚法的基礎(chǔ)上引入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，如-CO-NH2、-CH-NH2、CS-NH2以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑、蔗糖、硫酸銨以及巰基化合物均可干擾Folin-酚反應(yīng)。而濃度較低的尿素（0.5%左右）、硫酸鈉（1%左右）、硝酸鈉（1%左右）、三氯乙