醫(yī)學(xué)高級(jí)職稱論ppt課件

1、5-Aza-CdR對(duì)人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及TFPI-2 mRNA表達(dá)的影響5-Aza-CdR對(duì)人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及對(duì)人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及TFPI-2 mRNA表達(dá)的表達(dá)的影響影響 杜雅冰，邵應(yīng)舉，樊青霞，孫楨，王琳，趙培榮杜雅冰，邵應(yīng)舉，樊青霞，孫楨，王琳，趙培榮 作者單位：作者單位：(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州450002) 【摘要】目的討論【摘要】目的討論5-氮雜氮雜-2-脫氧胞苷脫氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干涉對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株干涉對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706生長(zhǎng)生長(zhǎng)增殖及其組

2、織因子途徑抑制物增殖及其組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表達(dá)的影響。方法選取食管鱗癌細(xì)胞株基因表達(dá)的影響。方法選取食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706，并用不同濃度的，并用不同濃度的5-Aza-CdR處置該細(xì)胞株。處置該細(xì)胞株。MTT法檢法檢測(cè)干涉前后細(xì)胞增長(zhǎng)率的變化，測(cè)干涉前后細(xì)胞增長(zhǎng)率的變化，F(xiàn)CM法檢測(cè)干涉前后細(xì)胞凋亡率法檢測(cè)干涉前后細(xì)胞凋亡率的變化，的變化，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)干涉前后技術(shù)檢測(cè)干涉前后Eca9706細(xì)胞細(xì)胞TFPI-2基因基因mRNA的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)干涉前后的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)干涉前后Eca9706

3、細(xì)胞細(xì)胞TFPI-2蛋白蛋白的表達(dá)。結(jié)果食管鱗癌細(xì)胞株的表達(dá)。結(jié)果食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706存在存在TFPI-2基因超甲基基因超甲基化形狀，經(jīng)化形狀，經(jīng)5-Aza-CdR處置后，超甲基化形狀解除，細(xì)胞增殖遭處置后，超甲基化形狀解除，細(xì)胞增殖遭到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯提高到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯提高(P0.05);細(xì)胞中細(xì)胞中TFPI-2蛋白表達(dá)明蛋白表達(dá)明顯加強(qiáng)，同時(shí)顯加強(qiáng)，同時(shí)mRNA的表達(dá)程度也較處置前明顯提高的表達(dá)程度也較處置前明顯提高(P0.05)。結(jié)論食管癌細(xì)胞系結(jié)論食管癌細(xì)胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其基因超甲基化可抑制其mRNA表達(dá)，表達(dá)，當(dāng)其超甲基化解除后，細(xì)胞增殖遭到抑制

4、，同時(shí)細(xì)胞凋亡率相應(yīng)當(dāng)其超甲基化解除后，細(xì)胞增殖遭到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡率相應(yīng)提高。提高。 【關(guān)鍵詞】 食管癌;組織因子途徑抑制物-2;5-氮雜-2-脫氧胞苷;甲基化;免疫組化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響;凋亡 ABSTRACT： ObjectiveTo explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza-CdR) intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibi

5、tor-2 (TFPI-2). MethodsEca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations; MTT， flow cytometry， immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine the cell growth， apoptosis， and the expression of TFPI-2 gene and its protein. ResultsEca9706 cell line had hypermethylation of TF

6、PI-2. After demethylation by 5-Aza-CdR treatment， the proliferation of Eca9706 was inhibited， the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner. RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly (P0.05). Conclusio

7、n5-Aza-CdR can slow the growth of Eca9706 cell， increase the apoptosis rate， reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation. KEY WORDS： esophageal carcinoma; tissue factor pathway inhibitor-2; 5-Aza-CdR; methylation; immunohistochemistry; RT-PCR; apoptosis 組織因子途徑移植物

8、2(tissue factor pathway inhibitor， TFPI-2)是絲氨酸蛋白酶抑制物，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。目前，關(guān)于TFPI-2在食管癌中的基因表達(dá)情況的分析研討尚少。本研討旨在討論TFPI-2基因的失活機(jī)制，并尋覓食管癌治療的新靶點(diǎn)。 1資料與方法 1.1資料 RPMI-1640培育基購(gòu)自北京索萊寶生物科技;規(guī)范胎牛血清購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技;Trizol試劑購(gòu)自MBI公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自MBI公司;5-Aza-CdR購(gòu)自Sigma公司;人食管癌細(xì)胞株Eca9706由鄭州大學(xué)腫瘤生物學(xué)研討室惠贈(zèng)。 1.2細(xì)胞培育和藥物處置 人食管癌細(xì)胞Ec

9、a9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培育基，37 、50 mL/L CO2培育箱培育，每23 d消化傳代1次。 1.3MTT法檢測(cè)干涉前后細(xì)胞增長(zhǎng)率的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度至5104/mL接種于96孔板，按5-Aza-CdR濃度分為6組：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，每組復(fù)設(shè)5個(gè)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別于24、48、72 h后參與MTT液，4 h后棄去上清液，每孔加DMSO 150 L，在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(absorbance，A)。細(xì)胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition r

10、ate， CPIR)按公式計(jì)算：CPIR=(1-實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值)100%。 1.4流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)干涉前后細(xì)胞凋亡率的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5105/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后加藥，分組如下：對(duì)照組(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR組，25.6 mol/L 5-Aza-CdR組，102.4 mol/L 5-Aza-CdR組。每組均于5-Aza-CdR作用48 h后消化搜集細(xì)胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式細(xì)胞儀進(jìn)展細(xì)胞凋亡測(cè)定。 1.5RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TFPI-2基因mRNA的表達(dá) 分組同F(xiàn)CM，每組細(xì)胞均5-Aza-CdR作

11、用48 h。TFPI-2的上、下游引物分別為5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3，合成產(chǎn)物為440 bp;-actin作為內(nèi)參照，上下游引物分別為5-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合成產(chǎn)物為301 bp。按照試劑盒闡明書，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit闡明書操作。先逆轉(zhuǎn)錄制備單鏈cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用上、下游產(chǎn)物進(jìn)展PCR反響擴(kuò)增

12、目的基因。反響條件為：94 預(yù)變性3 min，然后94 變性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循環(huán)30次，最后72 延伸5 min,4 保溫。擴(kuò)增片段經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 1.6免疫組化方法檢測(cè)TFPI-2蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5104/mL的密度接種于經(jīng)預(yù)處置的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后加藥(分組同RT-PCR)。培育48 h后參與40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封鎖內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫下10 min,100 mL/L動(dòng)物血清封鎖，室溫下10 min，滴加1 100的稀釋的TFPI-2抗體4 過(guò)夜，二抗室溫下1 h，滴加

13、辣根酶標(biāo)志鏈霉卵白素，37 孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片。另取爬片滴加PBS 液替代一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果斷定：TFPI-2蛋白陽(yáng)性信號(hào)均呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野(每個(gè)視野察看細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè))，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)展結(jié)果斷定。陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/1 000)100%。 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處置 運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)處置。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)規(guī)范差(x-s)表示，采用單要素方差分析加LSD兩兩比較法進(jìn)展分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。 2結(jié)果 2.1干涉前后細(xì)胞增長(zhǎng)率的變化 經(jīng)MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率明顯高于未加藥組

14、，且隨著作用時(shí)間的延伸和濃度的添加而添加(表1)。表1不同濃度的5-aza-CdR對(duì)Eca9706細(xì)胞增殖的影響 2.2干涉前后細(xì)胞凋亡率的變化 流式細(xì)胞儀分析可見(jiàn)，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR誘導(dǎo)48 h后，Eca9706細(xì)胞各處置組凋亡率分別為(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%，與5-Aza-CdR誘導(dǎo)濃度成正比。與對(duì)照組(1.390.27)%比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，且各濃度組間比較差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，圖1)。以上實(shí)驗(yàn)反復(fù)5次。 2.3干涉前后Eca9706細(xì)胞mRNA的表達(dá)情況 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，Eca9706

15、細(xì)胞中TFPI-2 mRNA表達(dá)在各用藥組和未用藥組之間有明顯差別，TFPI-2 mRNA在未用藥組細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)。經(jīng)1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR處置后可見(jiàn)TFPI-2 mRNA表達(dá)，闡明在一定范圍內(nèi)隨5-Aza-CdR藥物濃度的添加TFPI-2 mRNA表達(dá)逐漸加強(qiáng)(圖2)。圖1各組流式細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖A：對(duì)照組;B：1.6 mol/L 5-Aza-CdR組;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR組;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR組。圖25-Aza-CdR處置前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2 mRNA的表達(dá)M：DNA marker;-ac

16、tin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：對(duì)照組;2：102.4mol/L組;3：25.6 mol/L組;4：1.6 mol/L組;5：H2O對(duì)照組。,2.4干涉前后TFPI-2蛋白的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)5-Aza-CdR作用Eca9706細(xì)胞48 h，TFPI-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率添加，對(duì)照組、1.6 mol/L組、25.6 mol/L組、102.4 mol/L組TFPI-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同濃度組之間以及用藥組與對(duì)照組之間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，圖3)。圖

17、3各組TFPI-2蛋白的表達(dá)情況 3討論 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22區(qū)域，全長(zhǎng)由8164個(gè)堿基組成，其cDNA全長(zhǎng)為1 222 kb。其mRNA的啟動(dòng)子具有典型的管家基因特征，沒(méi)有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域GC含量超越80%1。TFPI-2可在體內(nèi)多種組織廣泛表達(dá)，在這些組織內(nèi)一旦出現(xiàn)腫瘤，TFPI-2的表達(dá)程度也會(huì)隨之顯著下降2。有研討證明，在絨毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和胸部惡性腫瘤組織中，與腫瘤產(chǎn)生相關(guān)的TFPI-2表達(dá)程度減少能夠與其啟動(dòng)子的甲基化親密相關(guān)1,3-5。啟動(dòng)子區(qū)cpG島高甲基化在腫瘤構(gòu)成機(jī)制中確實(shí)

18、切作用尚不清楚，然而眾多證聽(tīng)闡明，腫瘤抑癌基因CpG島異常的甲基化導(dǎo)致基因失活和轉(zhuǎn)錄抑制是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一6-8。 目前，有體外實(shí)驗(yàn)闡明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR經(jīng)過(guò)去甲基化作用可使多種含有CpG島的高甲基化抑癌基因重新表達(dá)，從而恢復(fù)抑癌功能9。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果顯示，TFPI-2在Eca9706細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，經(jīng)過(guò)不同濃度的5-Aza-CdR處置Eca9706細(xì)胞后，TFPI-2亦重新出現(xiàn)表達(dá)，且在一定范圍內(nèi)隨藥物誘導(dǎo)濃度的增大表達(dá)逐漸加強(qiáng)。MIZUNO等10研討闡明，腫瘤細(xì)胞中DNMT的表達(dá)較正常的高412倍，也證明DNMT上調(diào)參與腫瘤發(fā)生。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

19、根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)可知，經(jīng)過(guò)5-Aza-CdR干涉處置過(guò)的Eca9706細(xì)胞增殖明顯受抑制，且隨著藥物濃度的添加，抑制造用越明顯。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，DNA啟動(dòng)子區(qū)去甲基化能較明顯地抑制食管癌細(xì)胞增殖，并與其誘導(dǎo)劑量呈正相關(guān)，推測(cè)這種抑制造用與去甲基化后重新激活TFPI-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有著直接關(guān)系;此外能夠與去甲基化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。進(jìn)而經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR干涉的Eca9706的細(xì)胞中，用藥組與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率凋亡率有所添加，并且與5-Aza-CdR誘導(dǎo)劑量有依賴性關(guān)系。BENDER等11在同等條件下用5-Aza-CdR處置惡性腫瘤細(xì)胞系和正常纖維細(xì)胞

20、系時(shí)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖均被抑制，而纖維細(xì)胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR對(duì)Eca9706細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的添加不是藥物的毒性影響，能夠是由于使TFPI-2重新表達(dá)的結(jié)果。 目前，國(guó)外以TFPI-2為藥物研討靶點(diǎn)，就TFPI-2在腫瘤治療、腫瘤臨床診斷、促進(jìn)傷口愈合和動(dòng)脈粥樣硬化治療等領(lǐng)域中的運(yùn)用，也正在進(jìn)展廣泛深化的研討。本研討用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處置人食管癌Eca9706細(xì)胞株，檢測(cè)TFPI-2基因表達(dá)的變化及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期尋覓治療腫瘤的新靶點(diǎn)。 【參考文獻(xiàn)】 1HUBE F， REBERDIAU P， IOCHMANN S， et al. Cha

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