realtimePCR和RT-PCR詳解及其區(qū)別

1、real-time PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用摘要：一、實(shí)時熒光定量PCR原理 （一）定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。 （二）實(shí)時原理 1、常規(guī)PCR技術(shù)： 對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)一、實(shí)時熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。（二）實(shí)時原理1、常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時檢測。2、實(shí)時

2、定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析 3、如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析.4、幾個概念：（1）擴(kuò)增曲線 ：（2） 熒光閾值： （3）Ct值： CT值的重現(xiàn)性： 5、定量原理：理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線 6、絕對定量1）確定未知樣品的 C(t)值2）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量 7、DNA的熒光標(biāo)記

3、： 二、實(shí)時熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 2、SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時，DNA雙鏈分開，無熒光4、復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。 PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化: 1、SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測 2、Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn) 3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4、反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化5、反應(yīng)

4、溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定 6、其他與常規(guī)PCR相同（二）應(yīng)用范圍1、起始模板的測定；2、 基因型的分析；3、 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。（三）優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對DNA模板沒有選擇性；適用于任何DNA； 使用方便；不必設(shè)計復(fù)雜探針；非常靈敏； 便宜。 缺點(diǎn)：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性；但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件； 對引物特異性要求較高。方法二：TaqMan-水解型雜交探針 *5端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 *3端標(biāo)記有

5、熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)* 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光*Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針（一）工作原理 注意：每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光PCR反應(yīng)的建立：1、引物、探針的設(shè)計： 探針Tm為68-70 ，<30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400 bp，引物Tm為59-602、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72 ，45 S，3

6、、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，信號/背景比值的最大值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同（二）優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好缺點(diǎn)：只適合一個特定的目標(biāo);委托公司標(biāo)記，價格較高;不易找到本底低的探針Real-time PCR與RT-PCR比較2009-08-20 16:50:02 來源:未知 【大 中 小】 評論: 條摘要：Real-time PCR與RT-PCR是兩種不同的PCR方法，適用范圍也不同。 Real-time PCR中文譯作實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)，是一種最新發(fā)展的定量P

7、CR技術(shù)。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實(shí)時擴(kuò) Real-time PCR與RT-PCR是兩種不同的PCR方法，適用范圍也不同。Real-time PCR中文譯作“實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)”，是一種最新發(fā)展的定量PCR技術(shù)。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實(shí)時擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量，較以往常用的終點(diǎn)定量的方法更加準(zhǔn)確。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMa

8、n探針和SYBR Green I熒光染料兩種方法。Real-time PCR所采用的專用PCR儀能夠自動在每個循環(huán)的特定階段對反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，實(shí)時的記錄熒光強(qiáng)度的改變，從而對樣品的濃度進(jìn)行精確的定量。RT-PCR是Reverse transcription PCR的簡稱，中文譯作“逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)”，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模

9、板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。但二者的基本原理是相同的，即PCR技術(shù)。RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)2009-08-20 16:25:05 來源:未知 【大 中 小】 評論: 條摘要：一、知識背景： 1、基因表達(dá)：DNA RNA Protein 單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個蠶絲心蛋白基因 104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105

10、個絲心蛋白） 共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對于其功能水平的調(diào)控是非常重要的一、知識背景：1、基因表達(dá)：DNA RNA Protein單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個蠶絲心蛋白基因 104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白） 共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。 2、PCR技術(shù)(Polymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：A、變

11、性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向延伸。以上三步為一個循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNANA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準(zhǔn)備：

12、1、引物的設(shè)計及其原則：1）引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計是否合理對于整個實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2）引物設(shè)計原則的把握：引物設(shè)計原則包括a、引物長度:一般為1530bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)

13、3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：4060，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去510度。c、 3端要求：3端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。d、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個連續(xù)堿基互補(bǔ)，3端不應(yīng)超過2個。f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基存在。g、5端無嚴(yán)格限制：5末端堿基可以游離，但最好是G或C

14、，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊铩３Ｓ靡镌O(shè)計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設(shè)置。2、耗材：實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。3、試劑準(zhǔn)備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。三、RNA的提取方法：RTPCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但

15、RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。RTPCR步驟：1、RNA的提取： 2、cDNA的合成：逆轉(zhuǎn)錄體系的組成： DEPC處理水 8ul 10mM dNTPs 2.5ul Random primers 0.4ul RNasin 0.5ul 總RNA 2.53ug70 5min速置冰水中冷卻再加：5*逆轉(zhuǎn)錄buf

16、fer 5ul 逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) 1ul(200U) 加水至25ul37 60min90 5min3、PCR擴(kuò)增： 50ul PCR體系的組成： 10×PCRbuffer 5ul MgCl2 3ul(2.0mM) 10mMdNTPs 1ul sense primer 1ul(1umol/l) antisense primer 1ul(1umol/l) cDNA 1.5ul DEPC處理水 36.7ul Taq 酶 0.8ul(2.4U) 總體積 50ul 4、PCR反應(yīng)條件： 94 5min 94 1min 退火溫度 40sec 72 50sec 2 29 cycles 72

17、7min 4 0sec四、PCR條件的優(yōu)化：PCR條件的優(yōu)化主要是引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計軟件推薦溫度的上下2 變化尋找最佳退火溫度。此外Mg2濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2mM左右。引物和模板的量等。五、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定：根據(jù)產(chǎn)物長度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長度產(chǎn)物所需凝膠濃度）取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10V/cm電泳4560min。成像系統(tǒng)成像分析。分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（） 線性DNA片段的有效分離范圍（kb）0.5 1300.7 0.8121.0 0.5101.2 0.471.5

18、 0.23六、需注意的問題：1、注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、溴化乙錠（EB）、酚、異硫氰酸胍、紫外線等2、注意避免試劑污染3、始終注意避免RNA酶的污染：4、保管好自己專用的試劑，公用試劑保管好，相互協(xié)調(diào)，注意實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生Real time PCR 跟RT-PCR有什么區(qū)別關(guān)鍵詞： real time PCR RT-PCR 區(qū)別？ 2008-07-23 00:00 來源：丁香園 點(diǎn)擊次數(shù)：4932實(shí)時熒光定量PCR原理所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。1內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異,因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。2實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)實(shí)時熒光定量PCR