Tan第四章 目的基因的制備

1、2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 1本課程內(nèi)容 第一章第一章 緒論緒論 第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶 第三章第三章 基因工程的載體基因工程的載體 第四章第四章 目的基因的制備目的基因的制備 第五章第五章 目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選 第六章第六章 外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá) 第七章第七章 基因操作的基本技術(shù)基因操作的基本技術(shù) 第八章第八章 植物基因工程及應(yīng)用植物基因工程及應(yīng)用 第九章第九章 動(dòng)物基因工程及應(yīng)用動(dòng)物基因工程及應(yīng)用 第十章第十章 醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！

2、Slide 2第四章 目的基因的制備目的基因目的基因（target gene）是指已被或欲被分離、改造、擴(kuò)增和表達(dá)的特定是指已被或欲被分離、改造、擴(kuò)增和表達(dá)的特定基因或基因或DNA片段。片段。是編碼某一產(chǎn)物與某些性狀相關(guān)的基因是編碼某一產(chǎn)物與某些性狀相關(guān)的基因本章分兩節(jié)本章分兩節(jié)4.1 目的基因的制備方法目的基因的制備方法4.2 克隆基因的分離克隆基因的分離2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 34.1 目的基因的制備方法4.1.1 直接分離法直接分離法4.1.2 構(gòu)建基因文庫(kù)分離法構(gòu)建基因文庫(kù)分離法4.1.3 PCR法法4.1.4 化學(xué)合成法化學(xué)合成法2021年11月2

3、3日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 4 克隆基因的方法有很多，根據(jù)研究基礎(chǔ)的不同，可以克隆基因的方法有很多，根據(jù)研究基礎(chǔ)的不同，可以使使用以下的方法克隆目的基因用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或或RT-PCR法法2. 從基因文庫(kù)中分離基因從基因文庫(kù)中分離基因3. 從從cDNA文庫(kù)中分離基因文庫(kù)中分離基因4. 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法5. 圖位克隆法圖位克隆法6. 差減雜交法、扣除雜交、差異顯示法差減雜交法、扣除雜交、差異顯示法7. 人工合成法人工合成法本章中主要介紹從基因文庫(kù)中篩選目的基因的幾種方法。本章中主要介紹從基因文庫(kù)中篩選目的基因的幾種方法。獲得目的克隆的方法有兩種獲得目

4、的克隆的方法有兩種1） 目的基因的直接選擇目的基因的直接選擇2） 從基因文庫(kù)中篩選從基因文庫(kù)中篩選2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 54.1.1 直接分離法 直接選擇的基因比較少，如直接選擇的基因比較少，如抗生素抗性基因抗生素抗性基因。如克隆一。如克隆一個(gè)個(gè)kan抗性基因，在抗性基因，在R6-5質(zhì)粒上含有四種抗性基因：質(zhì)粒上含有四種抗性基因：kan, 氯霉素、鏈霉素、硫胺類(lèi)藥物，氯霉素、鏈霉素、硫胺類(lèi)藥物，kan抗性基因存在抗性基因存在于于13個(gè)個(gè)EcoRI片段中的一段中。將片段中的一段中。將R6-5的片段插入的片段插入pBR322的的EcoR I位點(diǎn)中，連接混合物中

5、將含有位點(diǎn)中，連接混合物中將含有13個(gè)不個(gè)不同片段的大量重組拷貝，其中部分是同片段的大量重組拷貝，其中部分是kan抗性的。只有抗性的。只有含含kan的克隆才能在含有的克隆才能在含有kan的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。1） 標(biāo)記援救可以擴(kuò)大直接選擇的范圍標(biāo)記援救可以擴(kuò)大直接選擇的范圍利用利用E. coli的突變系可擴(kuò)展該項(xiàng)技術(shù)。例如要從的突變系可擴(kuò)展該項(xiàng)技術(shù)。例如要從E. coli中克隆中克隆trpA基因，編碼色氨酸合成酶，一個(gè)突變系基因，編碼色氨酸合成酶，一個(gè)突變系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎

6、同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 6 因此因此E. coli的突變體可以用來(lái)克隆的突變體可以用來(lái)克隆trpA基因。首基因。首先從一個(gè)正常個(gè)體中提取總先從一個(gè)正常個(gè)體中提取總DNA，然后酶切，連，然后酶切，連接產(chǎn)生大量重組接產(chǎn)生大量重組DNA分子，其中一個(gè)將攜帶完整分子，其中一個(gè)將攜帶完整的的trpA基因。連接混合物用來(lái)轉(zhuǎn)化缺陷型基因。連接混合物用來(lái)轉(zhuǎn)化缺陷型E. coli細(xì)胞，大部分轉(zhuǎn)化子是缺陷型的，攜帶細(xì)胞，大部分轉(zhuǎn)化子是缺陷型的，攜帶trpA的重的重組子將是野生型的，可以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。組子將是野生型的，可以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 7直接選

7、擇法克隆直接選擇法克隆KanKan抗性基因抗性基因2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 8 2）標(biāo)記援救的范圍和限制存在兩個(gè)限制因素：1） 必須存在著目的基因的突變品系2） 需要一種只有野生型能夠生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。一般而言，標(biāo)記援救適用于微生物的合成酶可以在基本培養(yǎng)上選擇。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 9標(biāo)記拯救法克隆標(biāo)記拯救法克隆trpAtrpA基因基因 2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 10 4.1.2 構(gòu)建基因文庫(kù)分離法4.1.2.1 基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建4.1.2.2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建4.

8、1.2.3 基因文庫(kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 11基因文庫(kù)（gene library） 基因文庫(kù)：基因文庫(kù)：是某種特定的生物所含有的能夠包含是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合（所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合（將生物材料將生物材料的基因組的基因組DNA或或cDNA片段化，然后與特定的載體連接片段化，然后與特定的載體連接導(dǎo)入宿主菌形成包含目的基因在內(nèi)的導(dǎo)入宿主菌形成包含目的基因在內(nèi)的DNA片段的片段的克隆克隆群）群）?；蛭膸?kù)是通過(guò)純化細(xì)胞總?；蛭膸?kù)是通過(guò)純化細(xì)胞總DNA，然后利，然后利用特定的限制性酶酶切產(chǎn)生能插

9、入載體的片段，用特定的限制性酶酶切產(chǎn)生能插入載體的片段，一般是一般是替換載體、粘?；蛘呤翘鎿Q載體、粘?；蛘呤荵AC。 2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 12 對(duì)于植物、動(dòng)物，所需要的克隆數(shù)很大，鑒定目的基因是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。對(duì)于這些生物體，可以使用細(xì)胞特異的cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，插入載體中構(gòu)建的文庫(kù)。每一個(gè)細(xì)胞都含有相同的基因，但不同細(xì)胞中有的基因是表達(dá)的， 而有的基因關(guān)閉。只有少量基因在所有的細(xì)胞類(lèi)型中都表達(dá)，利用mRNA構(gòu)建的基因文庫(kù)，只含有表達(dá)的部分基因。例如麩朊（醇溶朊），小麥中的一種營(yíng)養(yǎng)蛋白，在正發(fā)育的種子中，以非常高的水平

10、表達(dá)，大約占總mRNA的30%。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 134.1.2.1 基因組文庫(kù)的構(gòu)建 基因組文庫(kù)（基因組文庫(kù)（genomic library） 某種生物的基因組的全部遺傳信息（某種生物的基因組的全部遺傳信息（DNA序列）通序列）通過(guò)克隆載體貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體即為過(guò)克隆載體貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫(kù)。這種生物的基因組文庫(kù)。 基因組文庫(kù)中的各克隆的插入片段疊加起來(lái)應(yīng)包含了基基因組文庫(kù)中的各克隆的插入片段疊加起來(lái)應(yīng)包含了基因組的全部序列。因組的全部序列。 基因組文庫(kù)的克隆數(shù)目基因組基因組文庫(kù)的克隆數(shù)目基因組D

11、NA總長(zhǎng)總長(zhǎng)/DNA插入片段插入片段的平均長(zhǎng)度的平均長(zhǎng)度 Clark 和和Carbon 提出估算基因組文庫(kù)大小的經(jīng)驗(yàn)公式：提出估算基因組文庫(kù)大小的經(jīng)驗(yàn)公式： Nln(1-P)/ln(1-f) N：基因文庫(kù)必需的克隆數(shù)目；：基因文庫(kù)必需的克隆數(shù)目； P：文庫(kù)中含目的基因：文庫(kù)中含目的基因DNA片段出現(xiàn)的概率；片段出現(xiàn)的概率； f：插入片段的大小與基因組大小的比值。：插入片段的大小與基因組大小的比值。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 14基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 15 噬菌體基因組文庫(kù)的構(gòu)建噬菌體基

12、因組文庫(kù)的構(gòu)建 Cosmid基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建 YAC基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 164.1.2.2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建步驟 cDNA文庫(kù)和文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的大小文庫(kù)的大小 cDNA文庫(kù)（文庫(kù)（cDNA library） 某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部mRNA經(jīng)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱(chēng)為貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱(chēng)為cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。 Nln(1-P)/ln(1-f) N：

13、cDNA基因文庫(kù)必需的克隆數(shù)目；基因文庫(kù)必需的克隆數(shù)目； P：文庫(kù)中含目的基因：文庫(kù)中含目的基因cDNA片段出現(xiàn)的概率；片段出現(xiàn)的概率； f：某種：某種mRNA的豐度與總的豐度與總mRNA的數(shù)的比值。的數(shù)的比值。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 172021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 182021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 19 因?yàn)槿魏我环N細(xì)胞中都只有部分基因表達(dá)，利用這一事實(shí)來(lái)制備基因文庫(kù)：制作文庫(kù)的起始材料不是DNA而是mRNA。 以mRNA為起始材料所得的克隆只包含整個(gè)細(xì)胞所有基因的一部分。 當(dāng)目的基因在某一細(xì)胞

14、類(lèi)型中高表達(dá)時(shí)，這種利用mRNA的克隆方法顯得特別有用。 例如，麥醇溶蛋白是小麥中一種重要的營(yíng)養(yǎng)蛋白，在發(fā)育的小麥種子中，編碼的麥醇溶蛋白基因高水平表達(dá)。 這些細(xì)胞中總mRNA的30是麥醇溶蛋白的mRNA。 顯然，如果從小麥種子中克隆mRNA，將會(huì)得到大量特異表達(dá)麥醇溶蛋白的克隆。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 20構(gòu)建步驟 分離純化分離純化總總RNA及及mRNA cDNA第一鏈的合成第一鏈的合成 雙鏈雙鏈cDNA合成合成 與載體重組、轉(zhuǎn)化與載體重組、轉(zhuǎn)化2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 21cDNAcDNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程（文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程（

15、1 1）2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 22cDNAcDNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程（文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程（2 2）2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 232021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 242021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 252021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 264.1.2.3 基因文庫(kù)的篩選 制備好合適的文庫(kù)后，可利用許多方法對(duì)目的克隆進(jìn)行鑒定。 雖然有一些方法是通過(guò)檢測(cè)克隆基因的翻譯產(chǎn)物來(lái)鑒定重組體的，但往往直接鑒定正確的重組體DNA分子更為容易。 這將用到一項(xiàng)重要的技術(shù)

16、探針雜交 (hybridization probing)技術(shù)。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 27 篩選目的克隆最常用的方法是探針雜交法。探針是由目的基因的已知的信息決定的，有三種可能性：1） 目的基因在特定細(xì)胞中的豐度2） 基因所編碼的蛋白質(zhì)或者部分序列3） 基因是一個(gè)基因家族中的一個(gè)2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 28探針雜交原理探針雜交原理 任意兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對(duì)的趨勢(shì)。但形成的大多數(shù)分子對(duì)由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。 但如果多聚核苷酸鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，堿基對(duì)的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。 這一現(xiàn)象不僅僅發(fā)生在

17、單鏈DNA分子之間形成DNA雙螺旋，單鏈RNA分子之間以及單鏈RNA與單鏈DNA之間也可以雜交。 如果用目的基因的互補(bǔ)DNA或RNA作探針，就可利用核酸雜交(nucleic acid hybridization)鑒定出特定的重組體克隆。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 292021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 302021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 31原位雜交技術(shù) 由于一項(xiàng)由于一項(xiàng)20世紀(jì)世紀(jì)70年代發(fā)展而來(lái)的新技術(shù)，我們年代發(fā)展而來(lái)的新技術(shù)，我們并不需要純化每一個(gè)重組體。這項(xiàng)技術(shù)就是原位并不需要純化每一個(gè)重組體。這項(xiàng)技

18、術(shù)就是原位雜交技術(shù)。雜交技術(shù)。 重組體重組體DNA分子無(wú)論是存在于菌落中還是存在于分子無(wú)論是存在于菌落中還是存在于噬菌斑中，都可以用雜交探針技術(shù)鑒定出來(lái)。噬菌斑中，都可以用雜交探針技術(shù)鑒定出來(lái)。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 32方法： 首先把菌落或是噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或是尼龍膜上，處理除去雜質(zhì)，只留下DNA。 通常以上處理步驟同時(shí)會(huì)使DNA分子變性，雙螺旋之間的氫鍵會(huì)斷裂。 如所用的是硝酸纖維膜，短時(shí)間的80的加熱會(huì)使這些單鏈DNA分子牢牢結(jié)合到膜上； 如果使用的是尼龍膜，處理方法相應(yīng)的改為紫外光照射。 DNA分子與膜結(jié)合的部分是它們磷酸化的五碳糖主鏈，這樣它

19、們的堿基是自由的，可以和互補(bǔ)的核酸分子配對(duì)。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 33 然后把探針加上標(biāo)簽，加熱變性，再加到適宜核酸退火的化學(xué)溶液中與膜結(jié)合。 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，等雜交已經(jīng)發(fā)生后，洗去沒(méi)有結(jié)合的探針，干燥，現(xiàn)在就可以檢測(cè)結(jié)合的探針的位置。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 342021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 352021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 362021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 372021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 38探針標(biāo)記

20、探針標(biāo)記傳統(tǒng)的方法是給探針標(biāo)記上放射性的核苷酸。 標(biāo)記的方法：缺口翻譯、末端填平、隨機(jī)引物法(random priming)圖8-10。 其中隨機(jī)引物法可以產(chǎn)生高活性的探針，能夠探測(cè)出與膜結(jié)合得很少量的DNA分子。 用以上方法，雜交信號(hào)的位置可以通過(guò)放射自顯影探測(cè)出來(lái)。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 392021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 402021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 41 不過(guò)，放射性標(biāo)記已不再流行，部分是因?yàn)樗鼘?duì)研究人員身體的傷害，部分是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)產(chǎn)生的放射性污染物的處理問(wèn)題。 已開(kāi)發(fā)出來(lái)的大量的非放射性方

21、法，下圖解釋了其中兩種操作流程。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 42第一種方法： 使用dUTP和生物素(biotin)反應(yīng)； 生物素是一種有機(jī)分子，與抗生物素蛋白(或親和素，avidin)有很高的親和性。 再用反應(yīng)產(chǎn)物去標(biāo)記探針，使探針帶上生物素。 雜交后，用結(jié)合熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白去檢出探針的位置。這種方法與放射性標(biāo)記具有相同的敏感度，正變得越來(lái)越流行。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 432021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 44另一種方法： 將探針DNA分子用辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxi

22、dase)標(biāo)記; 辣根過(guò)氧化物酶有降解魯米諾(氨基苯二酰肼)的活性，同時(shí)伴有化學(xué)熒光信號(hào)的發(fā)出。 與放射自顯影類(lèi)似，這種熒光信號(hào)可以被普通膠卷記錄下來(lái)。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 452021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 46雜交探針實(shí)際應(yīng)用的例子雜交探針實(shí)際應(yīng)用的例子 從菌落或是噬菌斑中鑒定某個(gè)特定重組體的方法能否成功的一個(gè)前提：是否可以得到合適的核酸分子作探針。 探針至少與被克隆的基因有著部分序列的互補(bǔ)性。 當(dāng)試驗(yàn)的目的是要獲得某個(gè)原本不了解的基因時(shí)，要用什么來(lái)作為探針呢? 2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 4

23、7實(shí)際上，可以通過(guò)已有的有關(guān)該基因的信息來(lái)確定探針的性質(zhì)。可以考慮以下3個(gè)可能性： (1)目標(biāo)基因在某種細(xì)胞類(lèi)型中高表達(dá)，可以考慮從這種特定細(xì)胞類(lèi)型的文庫(kù)中篩選該基因。 (2)該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列已知或者部分已知。 (3)該基因?qū)儆谀硞€(gè)已知的家族。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 48用高豐度重組體作探針?lè)治鲇酶哓S度重組體作探針?lè)治鯿DNA文庫(kù)文庫(kù) 當(dāng)我們想獲得在某種類(lèi)型的細(xì)胞中有相對(duì)較高的表達(dá)當(dāng)我們想獲得在某種類(lèi)型的細(xì)胞中有相對(duì)較高的表達(dá)量的基因克隆時(shí)，則先制備該細(xì)胞的量的基因克隆時(shí)，則先制備該細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。 如制備正在發(fā)育的小麥種子的如制備正在

24、發(fā)育的小麥種子的cDNA文庫(kù)中，有相當(dāng)文庫(kù)中，有相當(dāng)大比例的克隆是麥醇溶蛋白基因的大比例的克隆是麥醇溶蛋白基因的mRNA。 鑒定麥醇溶蛋白克?。河梦膸?kù)中的某一個(gè)鑒定麥醇溶蛋白克隆：用文庫(kù)中的某一個(gè)cDNA克隆克隆作探針去檢測(cè)文庫(kù)中的其他克隆作探針去檢測(cè)文庫(kù)中的其他克隆(圖圖8-12)。 隨機(jī)選擇一個(gè)克隆，純化重組隨機(jī)選擇一個(gè)克隆，純化重組DNA分子，作上標(biāo)記，分子，作上標(biāo)記，用作探針檢測(cè)其他克隆。用作探針檢測(cè)其他克隆。 用不同的克隆作探針重復(fù)以上步驟，直到發(fā)現(xiàn)某一個(gè)用不同的克隆作探針重復(fù)以上步驟，直到發(fā)現(xiàn)某一個(gè)克隆可以與文庫(kù)中相當(dāng)大比例的克隆相雜交。克隆可以與文庫(kù)中相當(dāng)大比例的克隆相雜交。 這

25、個(gè)豐富存在的這個(gè)豐富存在的cDNA被認(rèn)為很可能是麥醇溶蛋白，被認(rèn)為很可能是麥醇溶蛋白，并進(jìn)一步作更細(xì)致地分析以確定，如進(jìn)行并進(jìn)一步作更細(xì)致地分析以確定，如進(jìn)行DNA測(cè)序測(cè)序或是分離它的表達(dá)產(chǎn)物。或是分離它的表達(dá)產(chǎn)物。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 492021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 502021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 51用于編碼特定表達(dá)產(chǎn)物的基因的寡核苷酸探針用于編碼特定表達(dá)產(chǎn)物的基因的寡核苷酸探針 由于蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了四十多年，很多蛋白質(zhì)的序列也是已知的。 如果已知氨基酸序列，就可以用遺傳密碼來(lái)預(yù)測(cè)

26、相應(yīng)基因的DNA序列。 這種預(yù)測(cè)通常是不精確的，因?yàn)橹挥屑琢虬彼岷蜕彼釋?duì)應(yīng)一個(gè)三聯(lián)體密碼，其他所有的氨基酸都至少由兩個(gè)密碼子編碼。 然而，在大多數(shù)情況下，編碼同一個(gè)氨基酸的密碼子是有一定聯(lián)系的。 例如丙氨酸，被GCA，GCT，GCG和GCC編碼，三聯(lián)體密碼的三分之二可以很明確地預(yù)測(cè)出來(lái)的。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 52以細(xì)胞色素c為例說(shuō)明 細(xì)胞色素c是一種需氧生物的呼吸鏈中起重要作用的蛋白質(zhì)。早在1963年，就測(cè)出了來(lái)源于酵母的細(xì)胞色素c的氨基酸序列，結(jié)果顯示在圖8-13中。 這個(gè)序列包含一個(gè)片段，從第59個(gè)氨基酸起分別是Trp-Asp-Glu-Asn-As

27、n-Met。 由遺傳密碼可知，編碼這個(gè)六肽的DNA序列是TGG-GATC-GAAG-AATC-AAT/C-ATG。 盡管存在16種不同的可能序列，但18個(gè)核苷酸中有14個(gè)是可以精確地預(yù)測(cè)出來(lái)的。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 53實(shí)驗(yàn)室中，長(zhǎng)度小于實(shí)驗(yàn)室中，長(zhǎng)度小于50bp的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列是可以很容易被合成出來(lái)的是可以很容易被合成出來(lái)的2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 54據(jù)預(yù)測(cè)的核苷酸序列，可以合成所需的寡核苷酸探針，有可能用這個(gè)探針鑒定目的基因。細(xì)胞色素c這個(gè)例子中，合成編碼Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met的1

28、6種可能的寡核苷酸序列；分別使用16種探針或是混合作為一個(gè)探針庫(kù)，檢測(cè)酵母的基因組或是cDNA文庫(kù)(下圖8-15)。其中將會(huì)有一個(gè)探針是正確的序列，能夠和細(xì)胞色素c基因的那個(gè)區(qū)域相雜交，而雜交的信號(hào)將指示出是哪一個(gè)克隆攜帶了該基因。從細(xì)胞色素c的蛋白序列中選出另外一個(gè)不同的片段，據(jù)此合成另一套寡核苷酸探針，用來(lái)檢驗(yàn)第一次檢出的結(jié)果。但是第二個(gè)片段的選擇一定要注意：例如緊挨著上次選擇的另一個(gè)六肽Ser-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn，可能被幾千種不同的18bp的DNA序列編碼，很明顯不是一個(gè)合適的選擇。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 552021年11月23日

29、3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 562021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 57用于鑒定相關(guān)基因的異種探針技術(shù)用于鑒定相關(guān)基因的異種探針技術(shù) 比較來(lái)源于不同生物、編碼同一種蛋白質(zhì)的兩個(gè)基因時(shí)，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)它們有著很高的序列相似性，這反映了在進(jìn)化過(guò)程中基因結(jié)構(gòu)的保守性。因此，根據(jù)其中一個(gè)物種基因合成的探針往往也能夠與另一個(gè)物種基因進(jìn)行很牢固的雜交。盡管兩個(gè)DNA分子并不是完全互補(bǔ)的，只要能夠形成足夠多的核苷酸配對(duì)，雜交雙鏈仍然是很穩(wěn)定的。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 58 異種探針技術(shù)異種探針技術(shù)(heterologous probing)：

30、 利用幾種不同來(lái)源的DNA分子相應(yīng)序列間的雜交鑒定克隆的。例如，前面用寡核苷酸探針技術(shù)鑒定出了酵母的細(xì)胞色素c，可以作為雜交探針來(lái)鑒定其他生物中的細(xì)胞色素c基因，如脈孢菌(Neurospora crassa)中的細(xì)胞色素c基因。盡管它們并不完全配對(duì)，但足夠多的氫鍵保證了雜交結(jié)構(gòu)的形成，通過(guò)放射自顯影探測(cè)出雜交信號(hào)。 試驗(yàn)的操作條件會(huì)有一些變化，因?yàn)殡s交結(jié)構(gòu)并不是很穩(wěn)定，有可能在放射自顯影前丟失掉探針。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 592021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 60異種探針技術(shù)還可以用來(lái)鑒定同種生物內(nèi)的相關(guān)基因。 例如，前面部分鑒定

31、出了小麥的麥醇溶蛋白的cDNA克隆，用它作探針檢測(cè)整個(gè)小麥的基因組文庫(kù)，它雜交的不僅僅是它自身的基因，還會(huì)有一些其他的基因圖8-16(c)。它們都是與麥醇溶蛋白cDNA相關(guān)的基因，只在核苷酸序列上有著輕微的不同。 這是因?yàn)辂湸既艿鞍缀拖嚓P(guān)蛋白，形成了一個(gè)多基因家族(multigene family) 成員編碼的復(fù)雜群體。 一旦克隆了這個(gè)家族中的一個(gè)基因，用異種探針技術(shù)可以把該家族中的其他成員分離出來(lái)。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 612021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 622021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 63基于

32、檢測(cè)克隆基因產(chǎn)物的鑒定技術(shù)基于檢測(cè)克隆基因產(chǎn)物的鑒定技術(shù)要從一個(gè)基因文庫(kù)中鑒定某一特定的重組體，通常會(huì)優(yōu)先考慮雜交探針技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)有著很好的操作性，而且由于近幾年來(lái)的改進(jìn)，利用雜交探針技術(shù)可以在一次試驗(yàn)中檢測(cè)上萬(wàn)個(gè)重組體，從而把試驗(yàn)時(shí)間控制在一個(gè)相當(dāng)短的時(shí)間范圍內(nèi)。然而，必須首先獲得與目標(biāo)基因在序列上至少部分互補(bǔ)的探針，這有時(shí)限制了它的應(yīng)用。在有些情況下，需要使用另外一種策略。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 64雜交探針技術(shù)最主要的替代方法是免疫學(xué)篩查法(immunological screening)。它們的區(qū)別在于，雜交探針技術(shù)檢測(cè)的是克隆基因自身，而免疫學(xué)篩

33、查法檢測(cè)的是克隆基因編碼的蛋白。免疫學(xué)技術(shù)認(rèn)為，一旦克隆基因被表達(dá)，產(chǎn)物蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的含量將有別于它的正常含量。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 65免疫學(xué)檢測(cè)方法需要的抗體免疫學(xué)檢測(cè)方法需要的抗體 如果把純化后的蛋白質(zhì)樣品注射進(jìn)兔子的血液循環(huán)系統(tǒng)中，它的免疫系統(tǒng)將產(chǎn)生抗體來(lái)結(jié)合和幫助降解這些外源分子圖8-17(a)。 一旦兔子被某種外源蛋白質(zhì)所激發(fā)，它血液中的足以用來(lái)純化的高抗體水平將會(huì)持續(xù)好幾天。只要10 mL的血液就能提供相當(dāng)多的抗體圖8-17(b)。 被純化后的抗體，有特異性，只能與最初被注射進(jìn)兔子體內(nèi)的蛋白質(zhì)相結(jié)合。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)

34、們聽(tīng)課！Slide 662021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 672021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 68用純化后的抗體檢測(cè)重組體的蛋白質(zhì)用純化后的抗體檢測(cè)重組體的蛋白質(zhì) 有好幾種免疫學(xué)篩查的方法，但最常用的是直接配對(duì)檢出。 把重組體克隆轉(zhuǎn)移到聚脂膜上，裂解細(xì)胞，再加上包含特定抗體的溶液。 為了便于檢出，或者抗體本身直接標(biāo)記，或者抗原抗體結(jié)合后，用標(biāo)記后的蛋白A(protein A)溶液洗膜。蛋白A是一種細(xì)菌蛋白，可特異地與免疫球蛋白(抗體的主要成分)相結(jié)合。 標(biāo)記可以選擇放射性元素，以這種方式結(jié)合的標(biāo)記將通過(guò)放射自顯影而被檢測(cè)出來(lái)；或者也可以用熒

35、光或者化學(xué)發(fā)光的信號(hào)作標(biāo)記。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 692021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 702021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 714.1.3 PCR法 PCR: polymerase chain reaction (聚合酶鏈聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)式反應(yīng))。 DNA片段體外擴(kuò)增技術(shù)。片段體外擴(kuò)增技術(shù)。 要求待擴(kuò)增的要求待擴(kuò)增的DNA片段的序列必需是已知片段的序列必需是已知的。至少要求的。至少要求DNA片段的兩端約片段的兩端約20bp的序的序列是已知的，以便設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。列是已知的，以便設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。 只用于

36、檢測(cè)少量克隆的篩選。只用于檢測(cè)少量克隆的篩選。2021年11月23日3時(shí)08分歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！Slide 724.1.4 化學(xué)合成法 人工化學(xué)合成 隨化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)核酸合成儀已被廣泛應(yīng)用，按人們?cè)O(shè)計(jì)好的序列一次合成100-200bp長(zhǎng)的DNA片段已不成問(wèn)題?？赡苡眠@些合成的片段組合連接成完整的基因。但目前人工合成基因最大的限制是人們并未掌握怎樣的核酸序列能具有生命功能的規(guī)律，例如1kb長(zhǎng)的DNA最通常編碼功能蛋白質(zhì)的基因長(zhǎng)度就可以有10600種不同的序列，隨意合成的DNA絕大多數(shù)肯定是不具有生物功能或無(wú)法知道它會(huì)有什么功能的，因而只能模仿自然界生物中已知的基因序列來(lái)合成，而化學(xué)合成這樣長(zhǎng)的基因DNA序列，其價(jià)格遠(yuǎn)高于用PCR法獲得基因，所以目前很少