β-地中海貧血基因檢測(cè)(PCR-反向點(diǎn)雜交法20140929上午)

1、-地中海貧血基因檢測(cè)地中海貧血基因檢測(cè)（PCR-PCR-反向點(diǎn)雜交法）反向點(diǎn)雜交法） 地中海貧血是指鏈的合成受部分或完全抑制的一組血紅蛋白病。因本病多為點(diǎn)突變，故常用PCR加反向點(diǎn)雜交(RDB)確定突變類型。我國(guó)各民族的地貧基因突變情況有一定差異，南方漢族的突變基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(AT)、IVS-654(CT)和TATAbox-28(AG)為主，占85%90% 。1.掌握PCR技術(shù)原理及方法，熟悉其注意事項(xiàng)2.掌握反向點(diǎn)雜交技術(shù)原理及方法，熟悉其應(yīng)用【目的】PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國(guó)PE Cetus

2、公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單 一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基 因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值?！驹怼縋CR技術(shù)原理PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中

3、的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板53方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)的基本成分包括：模板DNA(待擴(kuò)增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)

4、：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的適溫延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)： PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y(1X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表

5、示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩亍４蠖鄶?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。反向斑點(diǎn)雜交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等1提出的一種斑點(diǎn)雜交技術(shù)，該技術(shù)采用固化了多種特異性探針的膜條與擴(kuò)增靶序列雜交，使一次雜交即可同時(shí)篩查被檢DNA中的多種突變

6、。這種以膜上固定探針取代固定靶DNA的方式，改變了傳統(tǒng)雜交法一次只能檢測(cè)一種突變的模式，具有快速、簡(jiǎn)便、高敏感度和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，尤其在基因突變檢測(cè)、基因分型、病原體的檢測(cè)等領(lǐng)域有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 【原理】反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)原理 反向斑點(diǎn)雜交采用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增，將產(chǎn)物同固定在尼龍膜上的探針進(jìn)行雜交，一次雜交反應(yīng)可以檢測(cè)多種靶序列。該方法具有快速、簡(jiǎn)便，高靈敏度和特異性的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、基因突變檢測(cè)、基因分型以及遺傳多態(tài)性檢測(cè)等多個(gè)方面，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值【操作步驟】1.DNA獲?。ㄒ褱?zhǔn)備好了） 2.PCR擴(kuò)增 ：反應(yīng)液管（做好記號(hào)）5000rpm，2秒加入 2ul DNA溶液總體積25微升PCR擴(kuò)增條件50， 15min95， 10min94， 1min55， 30sec72， 30sec72， 7min35cycles3.雜交 ：15ml管探針膜條（做好記號(hào)） A液 5-6mlDNA溶液（PCR產(chǎn)物）25ul沸水浴10min42雜交