影響ELISA結(jié)果常見因素和有效控制

1、影響elisa結(jié)果常見因素和有效控制摘要：elisa,也就是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是20世 紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種檢測(cè)技術(shù)，因其具有敏感性高、 特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體 的測(cè)定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動(dòng)作 用。從事檢驗(yàn)工作這些年，深知elisa測(cè)定中影響因素較多， 操作過程中每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，甚至出現(xiàn)錯(cuò) 誤的結(jié)果。為此，筆者在具體工作中對(duì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的常見 因素進(jìn)行了控制，取得了較好的效果。關(guān)鍵詞：elisa影響因素有效控制doi： 10. 3969/j. issn. 1671-8801. 2013.01.210【中圖分類號(hào)】r9【文獻(xiàn)標(biāo)

2、識(shí)碼】b【文章編號(hào)】 1671-8801 (2012) 01-0232-02elisa是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種檢測(cè)技術(shù)，因 其具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用 于各種抗原和抗體的測(cè)定，為輔助臨床診斷與生物科研起到 了積極的推動(dòng)作用。但該試驗(yàn)的影響因素較多，操作中如不 嚴(yán)格控制常常會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，在工作中我們注意收 集并分析影響結(jié)果的因素，適當(dāng)加以控制，效果較為理想。 現(xiàn)將影響因素及控制方法分析總結(jié)如下：1試劑的因素1.1試劑的選擇。試劑的選擇是保證檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵。 雖然國(guó)家采用批批檢定的形式對(duì)elisa試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不 同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。為

3、此，一定要選 購(gòu)知名度相對(duì)高、具有"三證”的試劑，最好選用與儀器配 套的試劑。切忌用無批號(hào)的試劑，更不要使用過期的試劑和 混用不同批號(hào)的試劑。1.2試劑的準(zhǔn)備。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)試劑的準(zhǔn)備一般不 太注意，通常的做法是在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即 用，而忽略了這種做法有可能影響后面時(shí)間不夠的問題，其 直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此， 在elisa測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，將試劑盒先從冰 箱中拿出來，在室溫下放置2030min后，再進(jìn)行測(cè)定，使 試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的目的能使反應(yīng)微孔內(nèi) 的溫度較快地達(dá)到所需的溫度，以滿足后面的測(cè)定需求。2樣本的因素2.

4、1內(nèi)源性干擾因素。包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度 的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等1。2. 1. 1類風(fēng)濕因子在類風(fēng)濕患者及正常人血清中，常含 有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子（rf）,其一般為igm型， 亦有igg和iga型，具有與變性igg產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn), 因?yàn)樵趀lisa測(cè)定中，其可與固相上包被的特異抗體igg以 及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體igg結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié) 果。避免其發(fā)生的方法有：用f (ab) 2替代完整的iggo 標(biāo)本用聯(lián)有熱變性igg的固相吸附劑處理。檢測(cè)抗原時(shí), 可用2-硫基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中使rf降解。2. 1.2補(bǔ)體在固相酶免疫測(cè)定中，來自哺乳動(dòng)

5、物的固相 抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面，固相 抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變 構(gòu)，使fc段的補(bǔ)體clq結(jié)合點(diǎn)暴露出來，使clq成為一個(gè) 中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另一方面，固相抗 體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能 力而引起假陰性。解決的辦法是：用edta稀釋標(biāo)本。56°c30min加熱血清使clq滅活1, 2 o2. 2外源性干擾因素。包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不全等。2. 2. 1標(biāo)本的溶血。血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶(hrp)為標(biāo)志的 elis

6、a測(cè)定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很容易 在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的hrp底物反應(yīng) 顯色。所以在采血時(shí)應(yīng)注意手法，采集的血液勿用力振蕩， 嚴(yán)防標(biāo)本溶血。2. 2.2標(biāo)本的污染。菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物 酶，可使實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)非特異性顯色。因此，elisa檢測(cè)宜采集 新鮮標(biāo)本，如不能當(dāng)時(shí)測(cè)定，5d之內(nèi)應(yīng)41保存，1周后檢 測(cè)應(yīng)低溫凍存；同時(shí)，收集標(biāo)本采用無菌試管，可防止標(biāo)本 的污染。2. 2.3標(biāo)本的保存。標(biāo)本在冰箱中保存過久，血清中igg 可聚合成多聚體，afp可形成二聚體，在用間接法測(cè)定中會(huì) 導(dǎo)致本底過深，甚至造成假陽(yáng)性。冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍 融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的

7、蛋白等分子有破壞作用，可引 起假陰性結(jié)果。因此，elisa檢測(cè)盡量采用新鮮標(biāo)本，長(zhǎng)時(shí) 凍存的樣本避免反復(fù)融凍3。2. 2.4標(biāo)本凝固不全。凝固不全的血清中含有部分纖維 蛋白原，可使結(jié)果呈假陽(yáng)性。解決的方法有：于采血管中 加入適當(dāng)?shù)目鼓齽?；將采集后的血液放在架子上再放?371水浴中l(wèi)h,待充分凝固后再離心分離血清4。3操作中的因素3. 1加樣。孵育前加樣時(shí)間過長(zhǎng)，酶試劑加出孔外，使 用滴瓶滴加試劑時(shí)，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致 使滴加的試劑量不準(zhǔn)，都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確?？刂品椒? 實(shí)驗(yàn)樣本過多時(shí)，可分批次操作，以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)造 成的誤差；加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；作定 量

8、試驗(yàn)時(shí)，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性，此 外，要做到一份樣本一個(gè)移液頭，防止交叉污染。3.2溫育。溫育是elisa測(cè)定最為關(guān)鍵、最容易出現(xiàn)問 題的步驟。最為常見的溫育溫度有371和室溫，其次是43°c 和28工。目前國(guó)內(nèi)售elisa試劑盒溫育時(shí)間為37°c, 30minlh,進(jìn)口 elisa試劑盒則通常為37°c, 12h能有 較完全的結(jié)合。3. 2. 1溫育時(shí)間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書 選擇溫育的時(shí)間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板 從室溫放入水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37。（2需 要一定時(shí)間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)

9、時(shí)，這樣 就容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，易致弱陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)不 出來。控制方法：如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫 度、較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件；用1個(gè)小溫度計(jì)放置在板孔反 應(yīng)液中測(cè)量觀察。3. 2.2 “邊緣效應(yīng)”的排除。“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的elisa測(cè)定中，外周孔顯色較 中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中 心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的，因此在溫育時(shí)盡量采用 水浴。3.3洗板。elisa測(cè)定的洗板一般有兩種方式，即手工 和洗板機(jī)洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采 用半自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹底，洗板針堵 塞導(dǎo)致抽吸不完全，洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差。

10、控制方法： 手工洗板時(shí)，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過 猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查 沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出； 為了洗滌效果好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方 法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板12次，或適當(dāng)增加洗 板的次數(shù)，有資料報(bào)道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果5。3.4顯色。市售elisa試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺(tmb)為底物，則提供的底物為a和b兩瓶應(yīng)用液；如以 鄰苯二胺(opd)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉 劑。顯色反應(yīng)條件為37t或室溫反應(yīng)1530mino以鄰苯二 胺(opd)為底物的試劑，要臨用前30min配制且

11、必須避光。 以四甲基聯(lián)苯胺(tmb)為底物的試劑則不需避光，但a、b 液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械。3. 5結(jié)果判定。讀取結(jié)果要在1530min內(nèi)完成，定性 測(cè)定用肉眼判讀試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景 1015cm；定量測(cè)定時(shí)用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，酶標(biāo)儀不應(yīng)置于 陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，需先預(yù)熱1530min再進(jìn)行測(cè)試。綜上所述，盡管elisa法操作簡(jiǎn)單，但可能影響測(cè)定結(jié) 果的因素也較多。故在實(shí)際操作的過程中，要加強(qiáng)質(zhì)量管理, 認(rèn)真避免或減少影響因素，力求結(jié)果準(zhǔn)確，為疾病的診斷和 科研提供可靠的依據(jù)。參考文獻(xiàn)1李寧.影響酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)j. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2006, 3 (7)： 314-3152宗永學(xué)，梅桂杰酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的影響因素及控制方法j中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué),2007