質(zhì)粒DNA提取純化及驗(yàn)證

1、 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2012年9月26 日 姓名 系年級(jí) 10級(jí)生命基地 組別 同組者 科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 質(zhì)粒DNA提取、純化和電泳檢測(cè) 學(xué)號(hào) 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握堿變性提取質(zhì)粒DNA法的原理、過(guò)程及各種試劑的作用。2、掌握凝膠電泳對(duì)DNA分離純化的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】1、提取、純化質(zhì)粒DNA（堿變性提取法）提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB一氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡(jiǎn)單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于

2、酶切、序列測(cè)定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來(lái)，但是兩者變性與復(fù)性所依賴(lài)的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)120的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。當(dāng)用pH值46的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與

3、不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無(wú)水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類(lèi)似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNase A將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。2、瓊脂糖凝膠電泳電泳（electrophoresis)是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝

4、膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(EB)或SYBR Gold染色直接觀(guān)察到，甚至含量少至20 Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。需要的話(huà)，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙

5、烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測(cè)定DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進(jìn)一步純化DNA等。瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面6個(gè)因素：1)樣品DNA分子的大小：電泳時(shí)，線(xiàn)性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量(所含堿基)的對(duì)數(shù)值成反比，這是因?yàn)榇蠓肿佑懈蟮哪Σ磷枇Α?)DNA分子的構(gòu)象：相對(duì)分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒

6、DNA過(guò)程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的一條鏈斷裂，變成開(kāi)環(huán)DNA(open circle DNA，oeDNA)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€(xiàn)狀DNA(1iner DNA，L DNA)分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線(xiàn)狀分子，最慢的是開(kāi)環(huán)狀分子。3)瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對(duì)分子質(zhì)量越大，選

7、用的凝膠濃度應(yīng)越低。4)電泳所用電場(chǎng)：低電壓條件下，線(xiàn)性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動(dòng)越快，但隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同長(zhǎng)度DNA泳動(dòng)的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)小于5 Vcm。5)緩沖液：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率。當(dāng)電泳液為去離子水(如不慎誤用去離子水配制凝膠)，溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動(dòng)很慢，DNA幾乎不移動(dòng)；而在高離子強(qiáng)度下(如錯(cuò)用10×電泳緩沖液)，導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動(dòng)很快，產(chǎn)生大量的熱，有時(shí)甚至熔化凝膠或使DNA變性。電泳時(shí)常用的緩沖液有乙酸鹽

8、（TAE）、硼酸鹽（TBE)和磷酸鹽（TPE）幾種不同的緩沖液，通常配制成10×或5×的濃度母液保存于室溫下，用時(shí)稀釋至工作濃度。TAE緩沖液緩沖能力弱，長(zhǎng)時(shí)間電泳緩沖能力逐漸喪失（陽(yáng)極變堿性，陰極變酸性），長(zhǎng)時(shí)間電泳需要更換緩沖液。TAE緩沖液可以分離數(shù)KB長(zhǎng)度的DNA，在精致DNA片段以及染色體DNA進(jìn)行雜交時(shí)經(jīng)常使用。 6)溫度：瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，不同大小DNA片段的相對(duì)電泳遷移率在430內(nèi)無(wú)變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進(jìn)行，而當(dāng)瓊脂糖含量少于05時(shí)，凝膠很脆弱，最好在4下電泳以增加凝膠強(qiáng)度?！緦?shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑】1、 儀器和材料接種環(huán)，培養(yǎng)皿，酒精燈，恒溫振

9、蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩器，微量移液器及多型號(hào)槍頭，微波爐，電泳儀等菌體： E.coli DH5受體菌，具有Ampr標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19。Maker: /Hind III DNA Maker DL2000 DNA Maker 點(diǎn)樣對(duì)照組： pUC19/ Hind II雙鏈線(xiàn)性DNA PUC19（商品） DNA2、 實(shí)驗(yàn)試劑LB培養(yǎng)基，抗生素（氨芐青霉素），溶液，溶液，溶液，3mol/L NaAc溶液，預(yù)冷無(wú)水乙醇，70%乙醇溶液，RNase A母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇(PCI)混合液，TAE電泳緩沖液（10×），溴化乙錠（EB)，上樣緩

10、沖液（6×）。溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。(1M Tris-HCl，12.5ml pH 8.0；0.5M EDTA 10ml pH 8.0 ，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121高壓滅菌15min ，貯存于4)。溶液：0.2M NaOH，1% SDS。(使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配置，防止NaOH吸收空氣中的H2O和CO2而減弱了堿性）。溶液：5M醋酸鉀（KAc）緩沖液60ml，冰醋酸11.5ml，重蒸水28.5ml，溶液中濃度K+3M,Ac-5M。【實(shí)驗(yàn)步驟】1、擴(kuò)增質(zhì)粒（

11、菌體培養(yǎng)） 1）在LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)具有Ampr標(biāo)記的E.coli DH5菌，37恒溫倒置培養(yǎng)16-18hr；之后，挑取單菌落，接種于20ml LB液體培養(yǎng)基（含Ampr80ug/ml）中，37，220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜12-14hr；再轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)行50或100倍稀釋?zhuān)瑯?7，220rpm振蕩培養(yǎng)4-6hr。2）對(duì)50mL的離心管稱(chēng)重（記為m1），取菌液30ml配平，6000rpm離心5min，棄去上清液；加入5ml溶液混勻，6000rpm離心5min,棄去上清液。取離心管稱(chēng)重（記為m2)，可測(cè)得菌體重量W=m2-m1。2、提取質(zhì)粒 1）向離心管中加入溶液（1.0ml/100mg菌體），漩

12、渦混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液（2.0ml/100mg菌體），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min； 向離心管中加入溶液（1.5ml/100mg菌體），輕柔顛倒混勻后，冰浴5min；離心管配平，12000rpm離心15min,取上清至新50ml離心管（記體積為v1) 2）加入2v1冰乙醇，顛倒混勻，-20保存30min，12000rpm離心15min,棄上清液,將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出。向沉淀中加入5mL70%乙醇進(jìn)行洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù)洗滌一次； 37下保存5min,至離心管內(nèi)干燥，加入1mlTE緩沖液溶解，得粗提物，將粗提物轉(zhuǎn)移至新EP管

13、，加入100ugRNase A（10ug/ul),將EP管放置于37下，保溫1-2小時(shí)。3、 純化質(zhì)粒 1）將提取物等分為500ul置于EP管中，加等體積酚液，混勻后，12000r離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(PCI)混合液，混勻后，12000rpm離心5min,轉(zhuǎn)上清至新EP管；加入等體積氯仿/異戊醇混合液，混勻后，12000rpm離心5min,將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管； 2）加入1/10體積的3mol/L NaAc，混勻后，加入2倍體積（包括上清液和1/10體積的NaAc)的冰乙醇，顛倒混勻，-20保存30min，12000rpm離心15min,棄去上清液

14、；加入5mL70%乙醇進(jìn)行洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù)洗滌一次； 37下保存5min,至沉淀干燥,每管加入25ul TE溶液,溫和振蕩幾秒鐘，至沉淀溶解。將2管整合到一管，得到50ul質(zhì)粒DNA組，放置-20下保存。4、凝膠電泳分離質(zhì)粒 1）制膠：1% 瓊脂糖凝膠：稱(chēng)取0.4g瓊脂糖于300ml三角燒瓶中，加40ml 1×TAE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60左右，三角瓶放在手面可堅(jiān)持1min即可，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TAE），即可上樣。 2）取3.0l純化DN

15、A加入1.0l上樣緩沖液，混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣完畢后，100V，200mA條件下電泳30min。電泳完畢后，進(jìn)行EB染色，用凝膠成像儀拍照，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！咀⒁馐马?xiàng)】1、在接菌時(shí)，注意無(wú)菌操作，物品應(yīng)在酒精燈火焰上方無(wú)菌區(qū)域內(nèi)。將挑有菌體的接種環(huán)在三角瓶壁上輕輕接觸，然后輕輕搖動(dòng)三角瓶，讓液體的LB培養(yǎng)基輕輕沖刷菌體，當(dāng)觀(guān)察到附近的LB培養(yǎng)基有輕微渾濁現(xiàn)象時(shí)，接菌成功，再輕輕震蕩三角瓶，使全部菌體進(jìn)入培養(yǎng)基中。2、注意離心機(jī)的使用，離心管要配平，以防錯(cuò)誤操作損壞離心機(jī)。離心結(jié)束后，將離心管從離心機(jī)取出時(shí)應(yīng)保持其傾斜狀態(tài)，防止沉淀重新進(jìn)入上清液中。3、為獲得高純度質(zhì)粒DNA，必須徹底除去雜蛋白、

16、染色體DNA和RNA。在整個(gè)提取過(guò)程中出去染色體DNA的關(guān)鍵步驟是加入溶液、溶液的變性和復(fù)性環(huán)節(jié)，應(yīng)控制好變形和復(fù)興的時(shí)機(jī)。加入溶液時(shí)，可劇烈震蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂；加入溶液時(shí)，菌液變粘稠、透明，無(wú)菌塊殘留；加入溶液時(shí)，會(huì)立即出現(xiàn)白色沉淀。加入溶液和溶液后，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在漩渦振蕩器上劇烈震蕩，否則，染色體DNA會(huì)斷裂成小片段，不會(huì)形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒DNA提純。因此，操作時(shí)一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的方法，既要使試劑與染色體DNA充分作用，又不破壞染色體的結(jié)構(gòu)。4、酚具有腐蝕性，能損傷皮膚

17、和衣物，使用時(shí)應(yīng)小心。皮膚如不小心沾到酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。5、沉淀DNA通常使用預(yù)冷無(wú)水乙醇，在低溫條件下長(zhǎng)時(shí)間放置可使DNA沉淀完全。除用乙醇沉淀DNA外，還可使用06倍體積的異丙醇，但異丙醇也能將鹽等雜質(zhì)沉淀，所以沉淀需要在常溫下進(jìn)行，并且時(shí)間不宜太長(zhǎng)(限20 min內(nèi))。沉淀離心后，需用70乙醇洗滌，以除去鹽類(lèi)及揮發(fā)性較小的異丙醇。、6、在低溫下提取質(zhì)粒DNA，收率較高。對(duì)于低拷貝治理，在收集細(xì)胞之前，用氯霉素適當(dāng)處理，可以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。 7、制備凝膠時(shí)，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則溶液將會(huì)爆沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度，可在微波爐中間歇性加熱，約沸騰

18、三次后，至凝膠溶解即可。同時(shí)，制膠時(shí)要將凝膠槽中的水擦拭干凈，避免對(duì)膠的均一性產(chǎn)生影響。8、電泳時(shí)最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳效果。如下一步實(shí)驗(yàn)要求較高，則應(yīng)盡量使用TAE電泳緩沖液，并且，配制瓊脂糖凝膠的電泳緩沖液應(yīng)與電泳時(shí)使用的緩沖液為同一批配制的。9、凝膠冷卻過(guò)程中，要自然冷卻，不要用冷水沖，否則會(huì)導(dǎo)致凝膠各部分不均勻，對(duì)電泳結(jié)果產(chǎn)生影響10、注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。11、紫外線(xiàn)對(duì)眼睛和皮膚均有危害性，對(duì)眼睛尤甚。為了最大限度避免受到輻射，要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽，并應(yīng)戴好目鏡(眼罩

19、)或能夠有效阻擋紫外線(xiàn)的全副完全罩，避免皮膚直接暴露在紫外線(xiàn)下。12、溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300 nm波長(zhǎng)的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來(lái)顯現(xiàn)瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸分子。溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。勿將溶液滴灑在臺(tái)面或地面上，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用水徹底沖洗干凈?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】（一）實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及數(shù)據(jù)記錄1、滅菌干燥離心管質(zhì)量： m1=15.711g； 菌液離心后離心管質(zhì)量： m2=15.807g； 菌體質(zhì)量： W=0.0960g；2、 加入溶液時(shí)，劇烈震蕩后，菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻渾濁

20、的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂； 加入溶液時(shí)，菌液變粘稠、透明，無(wú)菌塊殘留，打開(kāi)EP管時(shí)，可以看到粘稠的絲狀物。加入溶液時(shí)，立即出現(xiàn)白色絮狀沉淀，經(jīng)輕柔混勻后，沉淀漂浮在EP管上部。3、 電泳時(shí)可以明顯觀(guān)察到藍(lán)色條帶在電泳槽里由負(fù)極向正極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根。所以，電泳時(shí)必須注意凝膠擺放的位置，應(yīng)將點(diǎn)樣孔靠近負(fù)極方向擺放。（二）凝膠電泳結(jié)果從左至右各泳道的樣品及上樣量泳道12345121314151617樣品/HindIIIpUC19/ HindIIIpUC19(商品)JD-1JD-2JD-9JD-10DNAJD-5(-)JD-7(-)DL20

21、00樣量（µl）10.0100ng100ng3.03.03.03.06.03.03.05.0凝膠電泳觀(guān)察結(jié)果圖（三）結(jié)果分析1、凝膠電泳時(shí)，使用了2種DNA Maker，分別為位于第一泳道的/Hind III和位于最后一泳道的DL2000。其中，/Hind III DNA Maker可由HindI II酶切Lambda后得到的，本應(yīng)有8條帶，最后一條帶大小約為125bp,實(shí)驗(yàn)中一般很難觀(guān)察到；DL2000 DNA Marker是由單獨(dú)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合而成，包括6條DNA條帶，其DNA片段相比/Hind III DNA Maker要小，適用于比對(duì)較小的DNA片段。(2種Maker所

22、含DNA條帶大小已在上圖標(biāo)記)。2、質(zhì)粒DNA提取過(guò)程中，染色體DNA、蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì)仍有部分殘留，質(zhì)粒DNA有超螺旋、開(kāi)環(huán)、線(xiàn)性三種不同的狀態(tài)，這些因素導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組中每種樣品都可以觀(guān)察到多條帶。下面以我們組（JD-4）為例，通過(guò)橫向?qū)Ρ?，由上至下?duì)每一條帶進(jìn)行分析：1）蛋白質(zhì)條帶：點(diǎn)樣孔附近可以觀(guān)察到其周?chē)形⑷鯚晒猓砻骷兓蟮馁|(zhì)粒DNA仍含有少量蛋白質(zhì)。電泳時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子較大，很難通過(guò)瓊脂糖分子篩，所以殘留在點(diǎn)樣孔處。殘留的蛋白質(zhì)經(jīng)EB染色后，在紫外下可看到熒光，由于含量比較少，所以熒光比較弱。2）染色體DNA條帶：在點(diǎn)樣孔至23130bp的條帶間可以觀(guān)察到微弱的條帶，其條帶位置

23、同樣與14泳道的DNA相近，該條帶代表的是殘留的染色體DNA。其分子量比質(zhì)粒DNA大很多，所以在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度較慢，條帶靠近點(diǎn)樣孔。3）三種構(gòu)型質(zhì)粒DNA條帶：在4361bp至2000bp條帶間可以看到兩條帶：上面一條顏色很淺，條帶大小在4300bp左右，為開(kāi)環(huán)DNA分子；下面一條顏色很亮，條帶大小接近1900bp，與第三泳道的PUC19位與同一水平，為超螺旋DNA分子。與第二泳道的pUC19/ HindIII對(duì)比，可以推測(cè)在兩條帶間應(yīng)還有一線(xiàn)性DNA分子條帶，大小接近2500bp。正常情況下，由于沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的限制酶切割DNA分子，所以線(xiàn)性DNA分子比較難形成。在細(xì)菌體內(nèi)，質(zhì)粒DNA是以負(fù)

24、超螺旋構(gòu)型存在的。在瓊脂糖凝膠電泳中不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA,盡管分子量相同，但具有不同的電泳遷移率。其中跑在最前沿的是共價(jià)閉合DNA，其后依次是線(xiàn)性DNA和開(kāi)環(huán)DNA,其原因是共價(jià)閉合的DNA其空間位阻最小，所以跑得最快。而開(kāi)環(huán)DNA空間位阻最大，所以跑得最慢。4)RNA條帶：圖示中第15和16泳道為未加RNA酶的樣品，可見(jiàn)在500-100bp范圍內(nèi)有寬而亮的條帶，該條帶為RNA條帶。本組中，均加過(guò)RNA酶，RNA分解比較徹底，僅在100bp左右有一條很模糊的帶。（四）實(shí)驗(yàn)小結(jié)綜合以上分析，可以看出我們組（JD-4)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的質(zhì)粒DNA純度還算理想。染色體DNA和雙鏈開(kāi)環(huán)DNA含量少

25、，蛋白質(zhì)含量相對(duì)多一些。質(zhì)粒DNA條帶比較亮，其亮度大約為商品PUC19的3-4倍，故可以推測(cè)，提取的質(zhì)粒DNA濃度為PUC19濃度的3-4倍。【思考】1、質(zhì)粒提取過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)重要試劑及操作步驟的意義和作用。溶液的作用：葡萄糖使溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長(zhǎng)。Tris-Cl溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。溶液的作用：NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿

26、性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。溶液的作用： 十二烷基硫酸鈉（SDS sodium dodecylsulfate）遇到KAc后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。又SDS專(zhuān)門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，此外大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。 HAc中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件下會(huì)打斷基因組DNA，只要是50100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了。同時(shí)變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。該步反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了這一沉淀。冰浴使反應(yīng)更充分。冰乙醇作用：用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任