藥物跨膜轉(zhuǎn)運載體(doctor)

1、 一、 ABC類轉(zhuǎn)運體 ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)類物質(zhì)外排轉(zhuǎn)運載體。 這類轉(zhuǎn)載體轉(zhuǎn)運各種類型的底物如糖、氨基酸、金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)以及各種脂溶性物質(zhì)外排式跨膜轉(zhuǎn)運。 ABC類載體是許多生命過程必須的，缺陷可以引起多種疾病或與多種疾病有關如囊性纖維化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜變性、膽固醇和膽汁轉(zhuǎn)運缺失、貧血癥和藥物反應異常等。 特點：1。與ATP結(jié)合，利用ATP跨膜轉(zhuǎn)運物質(zhì)。底物分子轉(zhuǎn)運是單向的，通常是泵出細胞外。 2。結(jié)構(gòu)上：ATP-結(jié)合域, 稱之為核苷結(jié)合包( NBF) 和跨膜(TM)域。該域一般由6個-螺旋段組成。NBF 含3個保守區(qū)域Walker

2、A、Walker B和Walker C。在Walker A和B存在ATP結(jié)合點，而Walker C 為一簽名區(qū), 位于Walker B 的上游，C 區(qū)是相應ABC載體特有性的。 3。典型的ABC 載體有兩個NBF 和兩個TM域, NBF 存在于胞漿側(cè)。 發(fā)現(xiàn)48 個ABC 載體。 這些基因根據(jù)區(qū)域的構(gòu)成和氨基酸的同組關系分成7個亞型。 許多ABC載體在脂質(zhì)層的功能維持、脂肪酸轉(zhuǎn)運和類固醇類轉(zhuǎn)運方面有重要的作用。 已發(fā)現(xiàn)14種與人類疾病相關的ABC基因 ABCC2（Abcc2）基因突變：與Dubin-Johnson 綜合征有關。 ABCC2 蛋白存在于肝細胞的管側(cè)面膜上調(diào)節(jié)有機陰離子轉(zhuǎn)運。在多有

3、機陰離子轉(zhuǎn)運載體（TR-）的缺陷的大鼠中，該大鼠已用作Dubin-Johnson 綜合征的動物模型。 ABCB7基因的錯義與成高鐵紅細胞貧血癥和失調(diào)（XLSA/A）相關。 CFTR 蛋白為氯離子通道，與所有外分泌有關，缺陷導致膽囊纖維病變。 ABCC8 是磺酰脲受體，對磺酰脲藥物有高度的親和力?；酋ｋ孱愃幬餅橹委煼且葝u素依賴性糖尿病，主要促進胰島素的分泌。 ABCC8基因突變可能type II 糖尿病有關 。 二、多藥耐藥（藥物外排載體） 所有ABC的外排在體均存在于細胞膜上， 參與各種結(jié)構(gòu)類型的藥物、代謝物和化合物的外排。根據(jù)結(jié)構(gòu)類型，藥物外排載體分為四大類 。 ABC家族藥物轉(zhuǎn)運載體的預測

4、二級結(jié)構(gòu)。NBD, （ATP）核苷結(jié)合點, IN, 細胞內(nèi),OUT 細胞外 藥物載體在極性細胞（包括組織內(nèi)皮或上皮細胞）中的定位。 1. MDR1 P-糖蛋白(MDR1 P-glycoprotein) ABCB1. 又稱為MDR1，P-GP 或PGY1。 人MDR1MDR3藥物藥物，脂質(zhì)MDR基因MDR基因Mdr1a/mdr1bmdr2 藥物藥物，脂質(zhì) P-GP 有兩個相似和對稱的半載體組成,每個半載體有一個ATP結(jié)合點和6個TM域。兩個半載體只有43%氨基酸序列是一致的。 先與ATP結(jié)合，再水解是藥物轉(zhuǎn)運必需的。,不同的底物轉(zhuǎn)運需要的ATP分子是不同的，每轉(zhuǎn)運一個藥物分子出細胞,需要0.3-

5、3個分子的ATP。 P-gp 催化循環(huán)催化循環(huán). 藥物和 ATP與Pgp 結(jié)合 P-GP轉(zhuǎn)運柔紅霉素(DNR) 跨膜兩步過程。環(huán)孢素A (CsA), XR9576 (XR) 和長春堿 (VL)在細胞漿側(cè)面阻斷, 維拉帕米(VER)在細胞外側(cè)阻斷(優(yōu)先占領). 2. P-GP 底物 P-GP有各種類型的底物如秋水仙堿阿霉素、長春堿、脂質(zhì)、類固醇、化學異物和多肽等. 似乎無共性 1）多數(shù)底物是兩性分子 2)化合物脂溶性和氫鍵的數(shù)目決定底物與P-GP親和力的重要參數(shù)。 脂溶性大或氫鍵數(shù)目多，P-GP的親和性高. 電子供體基團間距離有一定范圍是識別P-GP結(jié)合點必需的，至少其中一個2.5 0.3，另一

6、個為4.6 0.6 MDR1 P-GP 抑制劑 第一代P-GP抑制劑如維拉帕米、環(huán)孢素 A 第二代或第三代抑制劑 PSC 833, GF120918 P-GP生理功能 1) 腫瘤細胞 耐藥原因之一 誘導性 2）正常體內(nèi)：生理性屏障（腸上皮、腦血管內(nèi)皮細胞、膽小管上皮細胞、胎盤合胞體滋養(yǎng)細胞） 1) 血腦屏障 在腦血管內(nèi)皮細胞腔側(cè)面表達豐富的P-GP, 成為許多藥物難以通過血腦屏障的原因; 一些疾病如癲癇誘導P-GP表達, 成為頑固性癲癇的原因之一 炎癥下調(diào)P-GP表達,導致血腦屏障的通透性顯著增加.Fig. Western blot showed expression of P-gp from

7、 the cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats. n=3. (*p0.01 vs Normal)Fig. P-gp functional activity in hippocampus and cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats. Samples of 60min after a single dose of 0.2mg/kg Rh123. n=4. (*p0.05, *p0.01 vs Normal)Fig . Distribution of PB in br

8、ain tissues of normal rats, kindled rats and kindled rats treated with CsA(5 mg/kg). Samples of 60min after a single dose of 10mg/kg PB. Data were expressed as ratio values as meanSD ( n=4). (*p0.05, *p0.01 vs normal rats, #p0.05, #p0.01 vs kindled rats). 2)在肝-膽和腸中作用 生物利用度的原因 (1) 保護機制 防止毒物由胃腸道進入體內(nèi)。

9、(2）腸上皮細胞中P-GP分泌功能成為許多藥物吸收差的原因之一, 成為藥物口服吸收的障礙。 野生型小鼠灌胃 50 mg/kg 紫衫醇約有95%的藥物原型從糞中排泄. 同時口服P-GP抑制劑環(huán)孢素A( 50 mg/kg), PSC 833(50 mg/kg), GF120918(25 mg/kg), LY335979(80mg/kg) 或R101933(80 mg/kg) , 顯著降低糞中原型藥物的排謝分數(shù)，分別為32.4%, 12.5%, 6.2%, 34.9%和73.6%。 在mdr1a/1b基因敲除小鼠，糞中原型排泄分數(shù)只有6%。 3) P-gP介導的藥物外排,符合載體轉(zhuǎn)運的特點，存在飽和

10、特性 某些底物的M-M常數(shù)化合物 標本 表觀Km（mol/l） 環(huán)孢素 Caco-2(凈B-A) 3.8 地高辛 Caco-2(凈B-A) 58 大鼠空腸片(凈-向A) 81 大鼠回腸片(凈-向A) 74 大鼠結(jié)腸片(凈B-A) 51 人結(jié)腸片(凈B-A) 59 依托甙 Caco-2(凈B-A) 213 大鼠空腸片(凈B-A) 94 大鼠結(jié)腸片(凈B-A) 119 維拉帕米 大鼠空腸片(凈B-A) 31 大鼠回腸片(凈B-A) 29 大鼠結(jié)腸片(凈B-A) 4.4 長春堿 Caco-2(凈B-A) 19， 27 大鼠回腸片(凈B-A) 48 大鼠結(jié)腸片(凈B-A) 100 不同底物和劑量腸道P

11、-GP的作用是不同的。 A. 地高辛通常劑量是0.5到1mg，腸內(nèi)的濃度不到10mol/l，低于Km 58 mol/l。P-Gp 在吸收方面有重要的意義，可能是該藥物吸收程度地和變異大的主要原因。 B. 劑量大于50mg，腸內(nèi)藥物濃度達到mmol/l 水平， 可能超過相應藥物的Km 值，P-GP的活性處于飽和，P-GP對藥物吸收的貢獻不大。 Indinavir：P-GP的底物，劑量高達 800mg，腸內(nèi)濃度超過 1 mmol/L, 遠遠大于Km 140 mol/L， p-GP的作用對貢獻不大。仍然有好的生物利用度 C.一些藥物如環(huán)孢素（200700mg）、紫杉醇（100200 mg），盡管劑量

12、很高，由于這些藥物的溶解度和釋放度低，腸內(nèi)的濃度低于Km值，但P-GP對吸收的影響仍然很大。 D. 某些藥物吸收程度隨劑量增加而增加如(S)-()-talinolol計量校正的AUC 由 12.5 mg 劑量的18 g .h/l 增加到 200 mg 劑量的36g .h/l。 4) 腸中P-GP也是機體重要保護機制之一，免受各種腸中毒素的侵害。如Mdr1a缺陷小鼠產(chǎn)生一種大腸炎癥，類似人類的腸內(nèi)部炎。正常情況下，腸中的P-GP 阻止毒素進入腸壁內(nèi). 復雜性和注意問題: 抑制胃腸道上P-GP功能, 必然降低屏障功能,增加毒物(素)進入體內(nèi)! 腸不同部位P-GP的表達不同. 圖6. 人腸中不同部位

13、P-gp和villin IOD ratio比值平均和變異.1/2代表十二指腸/近端空腸，3/4, 5/6, 和7/8 分別代表中段至遠端空腸，近端回腸支遠端回腸。3) 胎盤 屏障 P-GP 存在于胎盤合胞體滋養(yǎng)層頂側(cè)面膜。類似于血腦屏障，防止有毒物質(zhì)從母體進入胎兒。 在P-GP缺陷或基因敲除動物，avermectin, 地高辛, saquinavir和紫杉醇通透性增加1020倍。 對于多數(shù)治療藥物而言，在胎盤上的低通透性當然是需要的，但在有些情況下，成為治療上的障礙。如對于HIV治療，希望在嬰兒出生前，有一個合適的“負荷劑量”，降低在出生過程中母-嬰HIV感染的頻率乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)

14、1.乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein ,BCRP, ABCG2）。BCRP 只有一個NBF 和TM域，為半ABC 載體。 BCRP mRNA 最早發(fā)現(xiàn)于胎盤中。BCRP 首先是從乳腺癌細胞中分離得到的，稱之為乳腺癌耐藥蛋白。 第一次在耐阿霉素的MCF7乳腺癌細胞株(MCF-7/AdrVp)中克隆到BCRP。鼠類命名為Bcrp1 BCRP 是細胞株對絲裂霉素、阿霉素和柔紅霉素抗癌藥物等產(chǎn)生耐藥的主要原因。 BCRP主要在細胞膜上，存在于細胞的頂側(cè)面上. 2. BCRP/Bcrp1 介導的耐藥 BCRP 的底物與P-GP, MRP1和MRP2的底物間

15、有較大的重疊性 細胞株對絲裂霉素, 拓樸替康, 9-氨基喜樹堿, 柔紅霉素, SN-38, flavopiridol, 吲哚咔唑, 拓樸酶抑制劑( NB-506 和 J-107088) , 細胞染料如羅丹明123, Lysotracker綠 , BBR3390以及熒光素-BODIPY-prazosin. 對長春新堿, 紫杉醇和順鉑等抗癌藥無耐藥性 不同藥物誘導表達的結(jié)果往往存在差異。某些藥物誘導表達BCRP細胞株對蒽醌類有很高的耐藥性, 而另一些藥物誘導BCRP表達的細胞株, 相對絲裂霉素而言，則對蒽醌類幾乎沒有耐藥性。 有些誘導表達BCRP細胞株對拓樸替康的耐藥性相當高, 但另一些誘導表達B

16、CRP細胞株的耐藥很低存在兩種突變株：野生型 482 位上的氨基酸為Arg兩種突變型:Thr和Gly。不同的BCRP對底物的作用不同。野生型與突變型比較 野生型 突變型482 位A Arg Thr或Gly底物葉酸及其衍生物 + -羅丹明123 - +LysoTracker 綠 - +柔紅霉素 - +絲裂霉素 + +bodipy-prazosin + +Hoechst 33342 + +抑制劑新生霉素 + - 3. BCRP/Bcrp1 抑制劑 （1）GF120918 ; P-GP 抑制劑，也是有效的BCRP/Bcrp1 抑制劑; 抑制藥物外排泵BCRP和P-GP （2）fumitremorgi

17、n C (FTC), 是有效的BCRP-抑制劑,但在體有神經(jīng)毒性， 其中兩種類似物Ko132和 Ko134) 活性比FTC大，Ko134 細胞毒性很低，在體可以用很高劑量, 可以顯著增加小鼠口服拓撲替康的生物利用度 。 （3）某些HIV 蛋白酶抑制劑強效的BCRP抑制劑.z在表達野生型BCRP的HEK細胞株中，ritonavir,saquinavir 和nelfinavir 是有效地抑制 BCRP介導的絲裂霉素轉(zhuǎn)運，其IC50 分別為19.5, 19.5 和 12.5 mol/l。 （4）植物酚類化合物 ：5,7-二羥黃酮(Chrysin) 和biochanin A ，silymarin, 橙

18、皮素（hesperetin）, 櫟精（quercetin）, 黃豆苷（daidzein）, stilbene resveratrol。 （5）香豆霉素抗生素：新生霉素 （6）酪氨酸激酶抑制劑 ：STI-571(imatinib mesylate), ZD1839 (Iressa; gefitinib) 和 N-4-(3-溴苯)胺-6-喹唑啉-2-丁胺 (EKI-785) 4. BCRP/Bcrp1 組織分布 在人的胎盤中，BCRP mRNA 表達非常高，而在鼠類胎盤相對弱。 相反，在小鼠的腎臟表達最高，而在人的腎臟表達低表達。 BCRP 在胎盤合胞體滋養(yǎng)層膜的母體側(cè)、在肝細胞的膽管側(cè)、腸的腔面

19、側(cè)膜，與MDR1 P-GP的定位相似。BCRP 也存在與乳腺的小葉和排泄管的頂側(cè)面。 BCRP 高表達于鼠原始造血干細胞中。分化的造血干細胞系中，幾乎不表達，但前紅細胞和自然殺傷淋巴細胞可以表達Bcrp1。 在人中，BCRP表達與鼠相類似，在干細胞中有較高的表達，而在起源細胞表達降低，只有在自然殺傷細胞和成紅血球細胞表達，而在其他分化的細胞中沒有表達 BCRP 在腦血管內(nèi)皮細胞高度表達, 表達量高于MDR和MRP1. 3. BCRP/Bcrp1藥理生理作用 1） BCRP分布與P-GP有重疊性 提示BCRP/Bcrp1 的作用類似P-GP 。 2）保護機制 阻止從胃腸吸收毒物吸收,促進排泄 脫

20、鎂葉綠(甲酯-)酸 A（PHA）是葉綠素一種降解產(chǎn)物，為一種光毒性成分。PHA在體內(nèi)外排轉(zhuǎn)運是BCRP介導的，為ABCG2的特異性底物。 一項研究顯示Bcrp1/ 小鼠對的PHA光毒敏感性是的野生鼠100 倍以上，在敏感性增加的同時，伴隨隨高的血藥濃度。與正常食物比較，喂養(yǎng)含PHA 或含20%紫花苜蓿食物后，血藥濃度分別增加17和24倍，而野生鼠喂養(yǎng)任何食物，血漿中PHA濃度都在檢測濃度以下. 3）血腦屏障的重要組成部分之一。 與野生型鼠比較, mdr1a缺陷小鼠和野生型小鼠,長春堿腦攝取增加2倍,但哌唑嗪攝取不變不影響,絲裂霉素的攝取反而有所降低。 合用GF120918使哌唑嗪和絲裂霉素轉(zhuǎn)運

21、增加2.1和3倍, 但GF120918不影響長春堿的轉(zhuǎn)運。 在野生型鼠，PSC833增加長春堿的腦攝取, 但不影響和絲裂霉素的攝取。合用GF120918使哌唑嗪和絲裂霉素攝取分別增加1.5和2倍, GF120918也使長春堿的攝取增加。abcg2 mRNA 主要在腦微血管中表達，約是皮層的700 倍。 （4）在骨髓細胞的 “傍細胞群” （side population，SP）中作用。 從骨髓中分離到一類細胞，這類細胞用Hoechst 33342染色，結(jié)合雙波長熒光顯示淺紅色和淺藍色熒光，用維拉帕米預處理，淺著色細胞消失。這類細胞稱之為傍細胞群。 ？ 淺著色提示細胞內(nèi)Hoechst 33342濃

22、度低，研究顯示在SP細胞中表有BCRP/Bcrp1，促進Hoechst 33342外排所致. SP中富含未分化的干細胞，而在分化的干細胞系中BCRP/Bcrp1表達低或缺乏。類似SP也出現(xiàn)在骨骼肌和胚胎等其他組織干細胞, 伴隨Bcrp1 的高表達. BCRP/Bcrp1高表達可能是各種干細胞的一般特性. 功能？ ABCG2 基因缺陷引起骨髓中和骨骼肌中SP細胞數(shù)降低，用轉(zhuǎn)染BCRP（-/-）骨髓細胞移植小鼠內(nèi)導致細胞再注入（repopulation）能力降低，造血細胞對絲裂霉素敏感性增加 ,與正常小鼠比較，Mdr1a/1b 和 Bcrp1缺陷小鼠研究的各種造血功能正常，在SP幾乎消失.血祖先細

23、胞對絲列霉素的敏感性增加。 用 Bcrp+/+ 和Bcrp-/- 小鼠祖先細胞研究顯示，在正常氧功能條件下，兩種細胞的克隆數(shù)相同，但缺氧條件下，Bcrp-/- 小鼠祖先細胞的克隆數(shù)下降。阻斷BCRP功能顯著降低Bcrp+/+ 在缺氧條件下的生存力 。 ABCG2 mNRA 在造血干細胞（SP, 34+/38-. 34+/KDD+細胞群）中表達高，而在定向分化的祖細胞（34+/33+, 34+/10+）中表達顯著下降。在大多數(shù)成熟細胞中, 表達低, 但在自然殺傷細胞和成紅血球細胞表達高。ABCG2可能對造血干細胞中SP形成起重要的貢獻。 在定向分化階段，ABCG2 下調(diào)，暗示該基因可能在多能干細胞方面有獨特的生理功能.P-GP, MRP1和 MRP 2 的協(xié)同轉(zhuǎn)運 1. 協(xié)同轉(zhuǎn)運 許多ABC載體能同時轉(zhuǎn)運多種不同底物，可能存在協(xié)同轉(zhuǎn)運，增加轉(zhuǎn)運效率。 MRP1轉(zhuǎn)運長春新堿和依托甙需要還原型GSH參與。GSH 促進 MRP1依賴性的依托甙或長春新堿轉(zhuǎn)運，長春新堿和依托甙也刺激MRP1-依賴性的GSH. 用轉(zhuǎn)染的MRP2的Sf9細胞膜囊攝取試驗顯示不同物質(zhì)對MRP2轉(zhuǎn)運雌二醇-17