微生物細(xì)胞計數(shù)及染色操作

1、 學(xué)會血球計數(shù)板的使用方法 了解革蘭氏染色的原理了解革蘭氏染色的原理 學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法二二 酵母細(xì)胞計數(shù)原理酵母細(xì)胞計數(shù)原理 微生物常用的計數(shù)方法有兩種，即直接計數(shù)法和微生物常用的計數(shù)方法有兩種，即直接計數(shù)法和間接計數(shù)法。前者利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計間接計數(shù)法。前者利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，能立即得到數(shù)值，但死活細(xì)胞都計數(shù)在內(nèi)。后者數(shù)，能立即得到數(shù)值，但死活細(xì)胞都計數(shù)在內(nèi)。后者是在乎板上長成菌落后再計數(shù)，反應(yīng)較真實(shí)，但費(fèi)時是在乎板上長成菌落后再計數(shù)，反應(yīng)較真實(shí)，但費(fèi)時太長。本實(shí)驗(yàn)是利用血球計數(shù)板進(jìn)行直接計數(shù)。計數(shù)太長。本實(shí)驗(yàn)是利用血球計數(shù)板進(jìn)行

2、直接計數(shù)。計數(shù)前需對樣品做適當(dāng)稀釋，按照規(guī)定方法及計算公式運(yùn)前需對樣品做適當(dāng)稀釋，按照規(guī)定方法及計算公式運(yùn)算后，即可得出實(shí)際數(shù)值。算后，即可得出實(shí)際數(shù)值。 革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。 它是它是1884年由丹麥醫(yī)師年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。創(chuàng)立的。 革蘭氏染色法（革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細(xì)菌）不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭

3、氏陰性染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用細(xì)菌，用G-表示。表示。 細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。 肽聚糖肽聚糖(peptidoglycan)革蘭陽性菌肽聚糖革蘭陽性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽側(cè)鏈、五肽交聯(lián)橋聚糖骨架、四肽側(cè)鏈、五肽交聯(lián)橋青霉素作用點(diǎn)溶菌酶作用點(diǎn)N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸革蘭陰性菌肽聚糖革蘭陰性菌肽聚糖聚糖骨架、四肽側(cè)鏈聚糖骨架、四肽側(cè)鏈肽聚糖肽聚糖(peptidoglycan)革蘭陽性菌細(xì)胞壁特殊組分革蘭陽性菌細(xì)胞壁特殊組分壁磷壁酸膜磷壁酸革蘭陰性菌細(xì)

4、胞壁特殊組分革蘭陰性菌細(xì)胞壁特殊組分革蘭陽性菌與陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較革蘭陽性菌與陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較細(xì)胞壁細(xì)胞壁 革蘭陽性菌革蘭陽性菌革蘭陰性菌革蘭陰性菌強(qiáng)度強(qiáng)度較堅韌較堅韌較疏松較疏松厚度厚度20-80nm10-15nm肽聚糖層數(shù)肽聚糖層數(shù)可多達(dá)可多達(dá)50層層1-2層層肽聚糖含量肽聚糖含量占細(xì)胞壁干重占細(xì)胞壁干重50%-80%占細(xì)胞壁干重占細(xì)胞壁干重5%-20%磷壁酸磷壁酸+外膜外膜+脂蛋白脂蛋白+脂脂多糖多糖+ 革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basic dye）初染液；媒染劑）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（）；脫色劑（decolo

5、rising agent）和復(fù)染液（）和復(fù)染液（counterstain）。）。 堿性染料初染液堿性染料初染液結(jié)晶紫（結(jié)晶紫（crystal violet） 媒染劑媒染劑碘（碘（iodine） 脫色劑脫色劑95的酒精（的酒精（ethanol） 復(fù)染液復(fù)染液番紅番紅 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌、未知菌；大腸桿菌，枯草芽孢桿菌、未知菌； 草酸銨結(jié)晶紫，番水水溶液，碘液，草酸銨結(jié)晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，載玻片，顯微鏡等。乙醇，載玻片，顯微鏡等。 顯微鏡、物鏡測微尺、目鏡測微尺、血球顯微鏡、物鏡測微尺、目鏡測微尺、血球計數(shù)計數(shù) 板、載玻片等。板、載玻片等。 麥芽汁培養(yǎng)基、酵母菌。麥芽汁培養(yǎng)基、

6、酵母菌。 吸管、吸水紙等。吸管、吸水紙等。1涂片：將培養(yǎng)涂片：將培養(yǎng)24小時的大腸桿菌和未小時的大腸桿菌和未知菌，培養(yǎng)知菌，培養(yǎng)12-18小時的枯草芽孢桿球小時的枯草芽孢桿球菌、分別作涂片（注意涂片切不可過于菌、分別作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰12次即可，不可過熱，以載玻片不燙次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。手為宜。（一）（一） 染色實(shí)驗(yàn)染色實(shí)驗(yàn)（1）初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，）初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。水洗。（2）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。

7、分鐘，水洗。（3）脫色：將載玻片上面的水甩凈，并襯以）脫色：將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用白背景，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約不出現(xiàn)紫色時為止，約2030秒鐘，立即秒鐘，立即用水沖凈酒精。用水沖凈酒精。（4）復(fù)染：用番紅液染）復(fù)染：用番紅液染12分鐘，水洗。分鐘，水洗。（5）干燥和鏡檢：干燥后，置油鏡觀察。革）干燥和鏡檢：干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽

8、性。（6）同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽）同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對比。孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對比。 革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。大腸桿菌革蘭氏染色炭疽芽胞桿菌

9、炭疽芽胞桿菌(二二)酵母細(xì)胞數(shù)的測定操作方法酵母細(xì)胞數(shù)的測定操作方法1.血球計數(shù)板的構(gòu)造血球計數(shù)板的構(gòu)造 血球計數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻血球計數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個平臺。片制成的。玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面?zhèn)€刻有一個方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有每半邊上面?zhèn)€刻有一個方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室，供大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室，供微生物計數(shù)用。這一大方格的長和寬各為微生物計數(shù)用。這一大方格

10、的長和寬各為1m，深度深度為，其體積為為，其體積為0.1mm3。 計數(shù)室通常有兩種規(guī)格。一種是大方格內(nèi)分為計數(shù)室通常有兩種規(guī)格。一種是大方格內(nèi)分為16中中格，每一中格又分為格，每一中格又分為25小格；另一種是大方格內(nèi)分小格；另一種是大方格內(nèi)分為為25中格，每一中格又分為中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數(shù)小格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造；它們都有一個共同的特點(diǎn)，即每室是哪一種構(gòu)造；它們都有一個共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是由一大方格都是由1625=2516=400個小方格組成，個小方格組成，見圖。見圖。2.血球計數(shù)板的使用血球計數(shù)板的使用(1)用血球計數(shù)板計數(shù)酵母菌懸液的酵母菌個數(shù)。用血球

11、計數(shù)板計數(shù)酵母菌懸液的酵母菌個數(shù)。(2)樣品稀釋的目的是便于酵母菌懸液的計數(shù)，以每樣品稀釋的目的是便于酵母菌懸液的計數(shù)，以每小方格內(nèi)含有小方格內(nèi)含有4-5個酵母細(xì)胞為宜，一般稀釋個酵母細(xì)胞為宜，一般稀釋10倍即倍即可?？?。 (3)將血球計數(shù)板用擦鏡紙擦凈，在中央的計數(shù)室上加蓋專用的厚玻片。(4)將稀釋后的酵母菌懸液，用吸管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣，使菌液緩緩滲入，多余的菌液用吸水紙吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球計數(shù)室內(nèi)。(5)計數(shù)時，如果使用16格25格規(guī)格的計數(shù)室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格（即100個小格）的酵母菌數(shù)。如果規(guī)格為25格16格的計數(shù)板，除了取其4個

12、對角方位外，還需再數(shù)中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數(shù)。 4.血球計數(shù)板的清潔血球計數(shù)板的清潔 血球汁數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切血球汁數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用干，或用95的乙醇、無水乙醇、丙酮等有的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。 1結(jié)果結(jié)果列表比較大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和未知菌列表比較大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和未知菌的染色反應(yīng)，并判斷它們分