心臟成纖維細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)（精編版）

1、word格式乳鼠心肌成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物13 日齡二、c57 小鼠乳鼠試劑及配制10 只。高糖 dmem(gibco) 、型膠原酶（mp）、0.25%胰蛋白酶 (solarbo公司 ),胎牛血清（ gibco 160000-044 ）、青霉素 - 鏈霉素混合液（solarbo）。培養(yǎng)液 :dmem培養(yǎng)基： fbs：雙抗 100： 10： 1（ 45ml ： 5ml： 0.5ml ）酶消化液 : 將胰蛋白酶用pbs緩沖液 (ph7.2 7.4) 稀釋 , 配成 0.1%胰蛋白酶消化液; 將 型膠原酶溶于pbs緩沖液 (ph7.27.4)中, 配成 0.1%的膠原酶消化液。0.1%胰蛋

2、白酶及現(xiàn)配現(xiàn)01%型膠原酶以21 混合,用。三、實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)、 co2培養(yǎng)箱、光學(xué)倒置顯微鏡、離心機(jī)?四、組織消化和分離細(xì)胞1、將乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5,轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)。用大頭針將其固定在無菌的泡沫板上,用聚維酮碘消毒胸、腹部皮膚。2、取 2 把彎鑷子撕開皮膚,充分撕拉開 ,再用乙醇棉簽消毒。用眼科虹膜剪在劍突處正中線稍偏左向上開胸后用剪子壓住胸骨右緣,使心臟自然跳出,用彎鑷子勾住心臟根部,取出心臟 ,置于盛預(yù)冷pbs液的培養(yǎng)皿中。3、將鼠心臟全部取出后,剪去心房、剔除心臟上結(jié)締組織、脂肪及血管,預(yù)冷液清洗 3 次, 去除血污。4、將心臟剪成約1mm× 1mm× 1

3、mm的組織塊 ,刮入加有攪拌子的錐形瓶中,酶消化液沖洗剪刀及培養(yǎng)皿 ,轉(zhuǎn)移至錐形瓶中。5、加入孵育過的酶消化液為心肌組織的5 倍,37水浴 ,打開磁力攪拌器,60r/min攪拌10min,吸管輕輕吹打組織塊1min分散細(xì)胞 ,自然沉降 2min 后遺棄上清液。6、再次加入消化酶液8 15ml 消化 8min。五、培養(yǎng)細(xì)胞1、吸取上清液入離心管,加入預(yù)冷培養(yǎng)液2ml,吹打均勻后 ,1200r/min離心 4min,棄上清 ,細(xì)胞沉淀加預(yù)冷的培養(yǎng)液吹打后成細(xì)胞懸液用封口膜封口放于冰中備用。專業(yè)資料整理2、剩余組織塊重復(fù)上述過程若干次,直到組織塊消失,分次收獲細(xì)胞。3、將分次收獲的細(xì)胞懸液集中離心1

4、 次, 將所有細(xì)胞沉淀集中于一個(gè)離心管加適量培養(yǎng)液再離心 1 次。4、棄上清液加10ml 接種培養(yǎng)液吹打幾次以散開所有的細(xì)胞團(tuán)接種于培養(yǎng)瓶中,在 5%co 、295%空氣、 37培養(yǎng)箱中放置1.5h 。（ 1h）5、用預(yù)溫37的接種培養(yǎng)液輕輕洗刷培養(yǎng)瓶后收集培養(yǎng)液。至6、留下的貼壁細(xì)( 主要含心肌成纖維細(xì)) 加入含胎牛血清的培養(yǎng)10ml 繼續(xù)培,未貼胞胞液養(yǎng)壁的細(xì)胞混懸液分瓶后在同樣條件下再培養(yǎng)1.5h(60min),再收集貼壁細(xì)胞。根據(jù)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同,成纖維細(xì)胞貼壁速度較快,先附于瓶底。這樣采用反復(fù)差速貼壁1h, 獲得成纖維細(xì)胞。7、每 2 天換液 1 次。培養(yǎng)的心肌

5、成纖維細(xì)胞2 3天約 80% 90%細(xì)胞融合 , 用 0.25%胰蛋 ( 約白酶消化液按1× 105/ml細(xì)胞密度接種傳代培養(yǎng)1 3) 。（培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞23d至 80%90%細(xì)胞融合 , 用 0.15%胰蛋白酶消化傳代(1 ： 3)。第 24 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。）六、細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)臺(tái)盼藍(lán)染色、光學(xué)顯微鏡觀察。（詳見文獻(xiàn)）倒置顯微鏡下觀察有的交叉重疊生長,心肌成纖維細(xì)胞生長迅速,心肌成纖維細(xì)胞呈梭,胞體較,細(xì)胞漿透,形大明,與心肌細(xì)胞不同,23d即呈融合狀態(tài), 細(xì)胞排列緊,密細(xì)胞核較大,呈橢圓形,通常含23個(gè) 核 ,無自發(fā)性搏動(dòng)。參考文獻(xiàn)：1、張乃菊，陳天平，祝曉光. 乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)j.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010 ，