westernblot內(nèi)參

1、Western Blot 為什么必須要用內(nèi)參？ 心得點評 要檢測一個基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對變化，首選方法是 Western Blot 。因為 Western Blot 操作相對簡單方便，既可以定性分析表達(dá)產(chǎn)物，同時還可以指示目的蛋白量 的相對變化。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩做不出結(jié)果啦、假陽性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦畢竟，作為一種有 活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)畢竟不象 1+1 那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知 之甚少的表達(dá)產(chǎn)物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?W

2、estern Blot 實驗設(shè)計中要求有良好 的參照體系，對實驗結(jié)果分析是非常有用。特別是當(dāng)實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查 出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker (用來確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大小)，空白載體對照(如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對照)，已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn) 物的正對照；另外還有內(nèi)參。可是由于經(jīng)費(fèi)限制或者偷懶的原因，國內(nèi)的不少人做Western Blot 往往省略參照，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)問題時無法分析結(jié)果一一即便有結(jié)果也可能影響結(jié)果的分析。內(nèi)參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用 Western Blot 比較不同條件下或者不同組織中，

3、目的蛋白表達(dá)量的相對多少，前提條件是等量的細(xì)胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時，上 樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以你需要內(nèi)參。內(nèi)參即是內(nèi)部參照( Internal Control )，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼 表達(dá)的蛋白 (Housekeeping Proteins) ，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水 平變化時常用它來做參照物。在 Western Blotting 實驗中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等 量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì) 定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實

4、驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。在國外發(fā)表的文章中， Western Blotting 實驗結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國 內(nèi)仍有不少科研人員在 Western Blotting 實驗中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互 比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全 準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA Bradford，Lowry等幾種方法。BCA法與Lo

5、wry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。 Bradford 法敏感度最高，且與一系列干擾 Lowry， BCA 反應(yīng) 的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標(biāo)準(zhǔn)品 會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時需要等量上樣，此步 驟也存在操作誤差。在 Western blotting 實驗時使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差 進(jìn)行校正。在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在 WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)

6、相對恒定，借助檢測 每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為 空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個 Western Blot 顯色或者發(fā)光體系是否正常。實驗結(jié)果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實驗時，分別檢測樣品 的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各 樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的 實際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測內(nèi)參，觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大 小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行 Weste

7、rn Blotting 實驗，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行 不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結(jié)果更有說服力，更可信。畢 竟我們的實驗是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鳌３Ｓ玫牡鞍踪|(zhì)內(nèi)參有 GAPD(H glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase )和細(xì)胞骨架蛋白 beta-actin 或beta-tubulin 。最近的國外文獻(xiàn)報道中使用GAPDH內(nèi)參的較多。上海康成生物工程有限公司與國外實驗室合作開發(fā)的GAPDH 100 g l 一支，濃度為100卩g/100卩l(xiāng)，稀釋比達(dá)1: 10000以上,至少可做100次Western min

8、i-blots，價格僅為988元人民幣，并且只需 4°C保存運(yùn)輸，有效期長達(dá)兩年。這一產(chǎn)品大大降低了內(nèi)參的費(fèi)用，性能穩(wěn)定、質(zhì)量可靠、易于保存。在Western Blotting實驗過程中，由于使用的二級抗體往往會與總蛋白中本身含有的某些免疫球蛋白產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)生較強(qiáng)信號的雜帶。因此，上?？党缮锕こ逃邢薰就瞥隽薍RP標(biāo)記的GAPDH在任何情況下使用它都能夠得到單一的條帶結(jié)果，使得內(nèi)參的使用方法更為簡便準(zhǔn)確。這種操作省時，無需二級抗體反應(yīng)的 HRP標(biāo)記的GAPDF內(nèi)參不僅具備康成生物普通GAPDH勺所有優(yōu)點而且結(jié)果條帶單一，可避免二級抗體的非特異性反應(yīng)。售價為1498元人民幣100 g

9、l，稀釋比達(dá)1: 10000以上，至少可做100次Western mini-blots 。（ Tips :現(xiàn)在讀者在康成生物購買前面那個便宜的內(nèi)參時提及生物通就可以額外獲贈這個標(biāo)記內(nèi)參的10次使用裝）KD圖示：A-G分別表示不同實驗小鼠心臟蛋白（上樣量50ug），兔抗小鼠Akt抗體（康成生物Cat # KC-5A01）檢測心臟組織勻漿中 Akt水平。加入兔二抗（康成生物 Cat #KC-RB-035,稀釋比例為1 : 5，000）時 同時加入HRP標(biāo)記的抗GAPDI單抗（稀釋比例為1 : 10，000,康成生物Cat # KC-5G5。采用化學(xué)發(fā) 光試劑盒（康成生物 Cat # KC-420）

10、及X膠片曝光顯影。一次反應(yīng)即可同時檢測目的蛋白（ Akt，與內(nèi) 參GAPDH勺含量。目前，市場上供應(yīng)的其他內(nèi)參則均需要 -20 C保存，干冰運(yùn)輸：Sigma公司的Anti- p -Actin ，價 格為 241 美元 200 g l，可做 100 次左右的 Western mini-blots 。 Labvision 的 p -Actin 399 美元 1ml，可做 50 到 100 次 Western mini-blots; 209 美元 0.5ml，可做 25 到 50 次 Western mini-blots 。 CellSignaling Technology 的 BETA-ACTIN ANTIBODY只可做 10 次 Western mini-blots，美金價為 150 美元，人民幣售價為 1875 元。附：在 Western Blotting 實驗過程中使用內(nèi)參的方法有：一、超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時加入 HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。二、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進(jìn)行目的 蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使