福建農(nóng)林大學(xué) 蛋白質(zhì)工程期末總結(jié)

1、蛋白質(zhì)工程定義：以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成而改造現(xiàn)存蛋白質(zhì)或組建新型蛋白質(zhì)的現(xiàn)代生物技術(shù)。一級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子中各個氨基酸殘基的排列順序二級結(jié)構(gòu):一段連續(xù)的肽單位借助于氫鍵，在一維方向排量成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)想三級結(jié)構(gòu)：多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上在進(jìn)一步盤區(qū)或折疊成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)：由兩條或兩條以上的具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈聚合而成特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子叫蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)：是指若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體結(jié)構(gòu)域：二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)模體以特定的方式組織連接，在蛋白質(zhì)分子中形成2個或多個空間上可以明

2、顯區(qū)分的三級折疊實體同源蛋白質(zhì)指不同的有機(jī)體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)變構(gòu)效應(yīng)蛋白質(zhì)在表達(dá)功能的過程中構(gòu)象發(fā)生變化的現(xiàn)象蛋白質(zhì)的變性天然蛋白質(zhì)因受到物理和化學(xué)的因素影響，使蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性作用。 復(fù)性:是指變性的蛋白質(zhì)在使它變性的理化條件恢復(fù)正常后,它的結(jié)構(gòu)和功能可以部分恢復(fù)的性質(zhì)分子伴侶是進(jìn)化上十分保守的蛋白質(zhì)家族，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，其主要作用是與新生肽或部分折疊的蛋白質(zhì)的疏水表面結(jié)合，幫助新翻譯的蛋白的折疊或組裝成天然構(gòu)象的進(jìn)程，并防止其相互聚集和錯誤折疊。分子內(nèi)伴侶將對蛋白質(zhì)折疊有幫助的前導(dǎo)肽稱為分子內(nèi)伴

3、侶。定位突變：基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子“小改”是指對已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個殘基的修飾、替換或刪除等包含體：包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒生物信息學(xué)：生物分子信息的獲取、存貯、分析和利用一次數(shù)據(jù)庫：數(shù)據(jù)直接來源于實驗獲得的原始數(shù)據(jù)，僅對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單的歸類整理和注釋鹽析：蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出透 析：按照分子大小進(jìn)行分離.分離取決于透析袋截留的分子量。等電點沉淀法：在一定的pH條件下，蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀蛋白質(zhì)組是指基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。蛋白質(zhì)芯片也叫蛋白質(zhì)微陣列是將大量蛋白質(zhì)

4、有規(guī)則地固定到某種介質(zhì)載體上，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、酶與底物、蛋白質(zhì)與其他小分子之間的相互作用檢測分析蛋白質(zhì)的一種芯片蛋白檢測芯片：將具有高度親和特異性的蛋白質(zhì)或多肽，如單克隆抗體、小片段抗體、受體等固定在載體上信號肽：引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短（長度5-30個氨基酸）肽鏈蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾：通過活性基團(tuán)的引入或去除使蛋白質(zhì)化學(xué)(一級)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程蛋白功能芯片將天然蛋白、酶或酶底物固定在載體上制成芯片質(zhì)譜技術(shù)：生物質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異化來分離并確定分子質(zhì)量穿梭載體：構(gòu)建的具有兩種宿主(例如，大腸桿菌和釀酒酵母)復(fù)制原點的質(zhì)粒雙向

5、電泳第一向通常根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同進(jìn)行等電聚焦電泳（IEF），然后再根據(jù)分子質(zhì)量的不同進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）作為第二向。蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用：提高重組蛋白的活性、熱穩(wěn)定性及抗氧化能力，增強(qiáng)對胞內(nèi)蛋白酶的抗性，延長體內(nèi)半衰期，降低制品的免疫原性，改變酶促反應(yīng)的Km與Vmax，改變酶的底物專一性，改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)部位，減少反饋抑制，簡化純化過程，提高產(chǎn)率蛋白質(zhì)功能：催化/結(jié)構(gòu)成分/存儲/運動/轉(zhuǎn)運/調(diào)節(jié)/支架/蛋白質(zhì)大分子的應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于紡織/食品/醫(yī)藥/農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，酶制劑的工業(yè)用途如清潔，聚氨基酸的應(yīng)用去垢劑。氨基酸的理化性質(zhì)：旋光性：除甘氨酸外，都具有旋光性光吸收：酪氨

6、酸（Tyr、278nm）、色氨酸(Trp、279)和苯丙氨酸(Phe、259)能夠吸收紫外光共軛雙鍵紫外吸收：在中性pH值下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm處。蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)：二、三、四級空間結(jié)構(gòu)被破壞，變性因素破壞了維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的各種次級鍵以及二硫鍵。 但一級結(jié)構(gòu)完好，變性蛋白的特征：（1）生物活性的喪失最主要標(biāo)志 （2）理化性質(zhì)的改變：溶解度下降，易沉淀、結(jié)晶能力喪失、滲透壓力、和擴(kuò)散速度降低粘度、旋光性負(fù)值上升，等電點上升 （3）生化性質(zhì)的改變特征：分子伴侶的功能及特征幫助新翻譯的蛋白的折疊或組裝成天然構(gòu)象的進(jìn)程，并防止其相互聚集和錯誤折疊。（1

7、）同類分子伴侶在所有的生物中有驚人的相似性，表明它們在進(jìn)化很保守;（2）分子伴侶在行使功能時需水解以改變構(gòu)象、釋放底物和進(jìn)行再循環(huán);（3）能識別暴露的未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，能與多種不同的多肽相互作用，影響折疊的速率和動力學(xué)，無序列偏愛性。蛋白質(zhì)分子設(shè)計的原則：1活性設(shè)計2對專一性的設(shè)計3Scaffold設(shè)計(框架)4疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)需合理分布5最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列影響外源基因在大腸桿菌中有效表達(dá)的相關(guān)因素： 有效的轉(zhuǎn)錄起始與基因的高效表達(dá) (2)有效的翻譯與基因的高效表達(dá)（3）密碼子偏好性(4)外源蛋白的表達(dá)定位（5）宿主選擇對表達(dá)的影響（6）培養(yǎng)條件的控制表達(dá)效率的影響（7）轉(zhuǎn)錄終止區(qū)

8、蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定 1根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變2 利用蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基：高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結(jié)構(gòu)有關(guān)。非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。探測突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)整體性質(zhì)，以鑒定突變殘基。3 突變方法鑒定突變功能殘基：隨機(jī)突變技術(shù)、刪除分析、連接片段掃描突變定位突變的設(shè)計目標(biāo)及解決方法：定位突變常見的設(shè)計目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。 （1）熱穩(wěn)定性：引入二硫橋，增加內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積（2）對氧化的穩(wěn)定性：把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Ph

9、e或Tyr（3）對重金屬的穩(wěn)定性：替代表面羧基，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu（4）pH穩(wěn)定性：替換表面荷電基團(tuán)，His、Cys以及Tyr的置換(5) 提高酶學(xué)性質(zhì)：專一性的改變，增加逆轉(zhuǎn)數(shù)， 改變酸堿度原核和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點：目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個外源基因表達(dá)體系。優(yōu)點：遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；易培養(yǎng)；外源基因常可高效表達(dá)。不足：不可進(jìn)行典型的真核細(xì)胞所具有的翻譯后修飾。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)方法簡單、增殖快、生產(chǎn)成本低，但缺乏真核細(xì)胞特有的加工后處理，外源蛋白大量表達(dá)容易形成包涵體，而且在菌體中表達(dá)的外源蛋白，在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，易被

10、菌體蛋白酶破壞。酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核細(xì)胞的增殖快、操作簡單、成本低等優(yōu)點，又可以象其他真核細(xì)胞一樣完成對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯后的修飾。但它的蛋白水解酶類，可降解異體蛋白質(zhì)，使產(chǎn)品產(chǎn)量降低。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析方法X-射線晶體衍射法、核磁共振波譜、電鏡三維重構(gòu)、光譜技術(shù)、顯微技術(shù)和計算機(jī)模擬X-Ray晶體衍射方法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：分辨率高，能精確確定生物大分子中各原子的坐標(biāo)、鍵長、鍵角,給出生物大分子的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型,確定活性中心的位置和結(jié)構(gòu) 缺點：只能測定單晶，反映靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息，無法測定溶液中的信息核磁共振的優(yōu)缺點：優(yōu)點：可以在水溶液或有機(jī)相中研究生物大分子結(jié)構(gòu)，研究溶液條件的改變對生物大分子三維結(jié)

11、構(gòu)的影響以及生物大分子內(nèi)部動力學(xué)的特點缺點：分辨率不高。目前，NMR只能用于測定小分子和中型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)三大核酸數(shù)據(jù)庫：Genbank、EMBL、DDBJ蛋白質(zhì)分離的流程：選擇實驗材料；實驗材料預(yù)處理；蛋白質(zhì)的提?。坏鞍踪|(zhì)粗分級；蛋白質(zhì)細(xì)分級緩沖液的主要成分、作用、如何選擇緩沖液（1）提取不同的蛋白質(zhì)往往需要不同的緩沖液。2）原則：緩沖液不能與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用；選常用的緩沖液降低成本（3）為了使蛋白質(zhì)充分溶解并保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，含以下成分：P203緩沖對：還原劑 抑制劑 ：加入蛋白酶抑制劑螯合劑：為了消除某些金屬離子對目標(biāo)蛋白質(zhì)的影響，它們同時也是金屬蛋白酶的強(qiáng)烈抑制劑穩(wěn)定劑 ; 蛋白

12、質(zhì)在高濃度條件下，蛋白質(zhì)分子間相互作用，有利于降低溶劑對蛋白質(zhì)的不良影響。 去污劑 : 低濃度的去污劑有利于蛋白質(zhì)的溶解，但隨著去污劑濃度的提高，有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。防腐劑分子篩層析也稱凝膠層析原理：1、分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；2、小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。填料具備的條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。離子交換層析原理：蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質(zhì)也存在等電點（pI），蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀況同氨基酸相同，取決于所處溶液的pH 值。分類：陽離子交換與陰離子交換

13、樹脂類：分離氨基酸，孔徑??；纖維素類：分離蛋白質(zhì)，孔徑大。通過改變鹽濃度，輔助改變pH值進(jìn)行梯度洗脫注意：陽離子交換劑本身帶負(fù)電荷，陰離子交換劑本身帶正電荷通過改變鹽濃度，輔助改變pH值進(jìn)行梯度洗脫。當(dāng)pI < pH時，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；當(dāng) pI > pH時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷親和層析原理： 依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（ligand）之間的專一識別并結(jié)合的特性來分離蛋白質(zhì)。 配體通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合（一般是非共價結(jié)合）的分子、基團(tuán)、離子、或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合，配體可以是酶結(jié)合的一個反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體. 蛋白質(zhì)免疫印跡主

14、要包括三個步驟：第一步是凝膠電泳；第二步是轉(zhuǎn)膜，把凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移固定到薄膜上；第三步是抗原抗體顯色反應(yīng)。原理：將混合抗原樣品在凝膠板上進(jìn)行單向或雙向電泳分離, 然后取固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼。在印跡紙的自然吸附力、電場力或其它外力作用下, 使凝膠中的單一抗原組份轉(zhuǎn)移到印跡紙上, 并且固相化。最后應(yīng)用免疫覆蓋液技術(shù)如免疫同位素探針或免疫酶探針等, 對抗原固定化基質(zhì)膜進(jìn)行檢測和分析。是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法酵母雙雜交技術(shù)是一種有效的真核活細(xì)胞內(nèi)研究方法，在蛋白質(zhì)相互作用研究方面得到了廣泛應(yīng)用并取得了許多有價值的重要發(fā)現(xiàn)。酵母雙雜交系統(tǒng)由三個部分組成：BD 融合

15、的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）； AD 融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱為靶蛋白（prey）；有一個或多個報告基因的宿主菌株。原理：不同來源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因的表達(dá)，基于這個原理，可將兩個待測蛋白分別與這兩個結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共同表達(dá)于同一個酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個待測蛋白間能夠發(fā)生相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報告基因表達(dá)。通過報告基因的表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。噬菌體展示技術(shù)：原理：噬菌體展示技術(shù)就是將待篩選基因插入噬菌體信號肽序列與主要

16、衣殼蛋白基因（主要是基因或基因）之間，構(gòu)成融合蛋白噬菌體庫。表達(dá)的融合蛋白可以呈現(xiàn)在噬菌體表面，但不影響噬菌體的完整性和活性。蛋白質(zhì)組學(xué)的難點：蛋白質(zhì)組的多樣性 蛋白質(zhì)的種類確定 蛋白質(zhì)組的動態(tài)性 蛋白質(zhì)組的時空性 蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù) 蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)：雙向電泳技術(shù)（2DE）計算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù) 質(zhì)譜技術(shù)(MS)質(zhì)譜技術(shù)：生物質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異化來分離并確定分子質(zhì)量。它具有高通量、靈敏、準(zhǔn)確、自動化等特點，已逐步取代傳統(tǒng)的Edman降解測序和氨基酸組成分析，成為蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于二維電泳、色譜分離

17、的蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)復(fù)合體的鑒定染色方法的優(yōu)缺點:考馬斯亮蘭: 靈敏度較低，但染色過程簡單，所需試劑少，操作簡便，無毒性，染色后背景及對比度好，與下游質(zhì)譜兼容，線性程度好。銀染（Silver Stain ）: 檢測靈敏度很高，可達(dá)到200pg，但其線性很差。普通的銀染過程中因醛類的特異反應(yīng)，而與下游質(zhì)譜不兼容?？焖巽y染法，可與下游質(zhì)譜兼容，但其檢測靈敏度較低，并伴有很深的背景干擾。熒光染色：靈敏度2-10ng，靈敏度與銀染相仿，不對核酸染色染色所需時間較短染色的動態(tài)線性范圍大大優(yōu)于膠體金染色，擴(kuò)展了約1000倍。熒光試劑顯色對蛋白質(zhì)無固定作用，不干擾質(zhì)譜或免疫檢測過程蛋白芯片技術(shù)：的研究對象是

18、蛋白質(zhì)，其原理是對固相載體進(jìn)行特殊的化學(xué)處理，再將已知的蛋白分子產(chǎn)物固定其上（如酶、抗原、抗體、受體、配體、細(xì)胞因子等），根據(jù)這些生物分子的特性，捕獲能與之特異性結(jié)合的待測蛋白（存在于血清、血漿、淋巴、間質(zhì)液、尿液、滲出液、細(xì)胞溶解液、分泌液等），經(jīng)洗滌、純化，再進(jìn)行確認(rèn)和生化分析；它為獲得重要生命信息（如未知蛋白組分、序列。體內(nèi)表達(dá)水平生物學(xué)功能、與其他分子的相互調(diào)控關(guān)系、藥物篩選、藥物靶位的選擇等）提供有力的技術(shù)支持。質(zhì)分子的固定化方法優(yōu)點缺點吸附法條件溫和，操作簡單，成本低，載體可再生，反復(fù)使用結(jié)合力弱，對pH、離子強(qiáng)度、溫度等因素敏感，酶易脫落，酶的裝載容量少包埋法包埋材料、包埋方法可選余地大，固定化酶的使用面廣，包埋條件溫和僅用于低分子量的底物，不適用于柱系統(tǒng)，常有擴(kuò)散限制問題共價結(jié)合法載體與偶聯(lián)方法可選擇性大，酶的結(jié)合力強(qiáng)，非常穩(wěn)