血液制品中人細(xì)小病毒B19滅活探究新進(jìn)展

1、血液制品中人細(xì)小病毒b19滅活探究新進(jìn)展【摘要】目的：獻(xiàn)血員人細(xì)小病毒b19感染率高， 導(dǎo)致了血液制品中人細(xì)小病毒b19污染率高，血液制品生產(chǎn) 工藝中現(xiàn)有的病毒滅活方法（如如亞甲基藍(lán)光化學(xué)法）不能 將人細(xì)小病毒b19有效滅活。因此存在經(jīng)血源傳播人細(xì)小病 毒b19的風(fēng)險，所以對血液制品中人細(xì)小病毒b19有效去除、 滅活刻不容緩。一種新的短波紫外滅活法對細(xì)小病毒b19滅 活效果好，蛋白回收率高，具有很好的研究應(yīng)用前景?！娟P(guān)鍵詞】：人細(xì)小病毒b19；血液制品；感染率；紫 外滅活new progress in study of inactivation of human parvovirus b19

2、in blood products yang bojial, zhang xianpengl,panxiuyin2, nie xingjiao2, chen sai, zhang li , lu jianming1. department of transfusion ,zhijiang people，s hospital, yichang, hubei 443200, china ；2.yichang blood center ；3.department oftransfusion , the central hospital of yichang ； 4.xingshan substati

3、on ,yichang blood center ；5.department of transfusion, renhe hospital affiliated to china three gorges universityabstract :the high infection rate of human parvovirus b19 (hpvb19) in blood donors resulted in the high pollution rate of the hpvb19 in blood products. the current methods of virus inacti

4、vation in processing technique on blood products (such as methylene blue chemical method ) could not inactivate hpvb19 effectively. there was a risk of blood transmission of the hpvb19, so it was mos t urge nt to elimina te and inactivate the hpvb19 in blood products a new method of shortwave ultrav

5、iolet had good effect on hpvb19 inactivation, and the protein recovery was high, so it showed a good future of research and application.key words: hpvb19； blood products； infection rate； uv inactivation【中圖分類號】r331. 1【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】a【文章編號】2095-6851 (2014) 04-0623-01血液制品不可替代的療效和安全性關(guān)系著人民的生命 健康血液制品的病毒安全性控制是血液制品

6、(血漿蛋白衍生 物)的安全與質(zhì)量控制的關(guān)鍵，世界各國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)都非 常關(guān)注這一問題?？山?jīng)血/血液制品傳播的病毒有甲型肝炎 病毒(hav)、乙型肝炎病毒(hbv).人免疫缺陷病毒(hiv)、 人類細(xì)小病毒(b19),巨細(xì)胞病毒(cmv)以及人類航病 毒1?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外普遍采用原料血漿病原體篩查、原 料血漿檢疫期管理和血漿蛋白分離過程中增加病毒滅活/去 除工藝等不同手段，進(jìn)行病毒安全性控制，以最大限度降低 血液制品病原體污染的風(fēng)險。另外各種病原體核酸擴(kuò)增檢測 技術(shù)從生產(chǎn)源頭起作用，以靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)成為 迄今為止最靈敏的病毒檢測方法，已經(jīng)廣泛用于原料血漿的 病原體早期篩查。該方法顯著降

7、低了 hiv、hcv和hbv的血 清學(xué)檢測的窗口期，hiv可以減少10-11天、hcv可以減少 57-59天、hbv可以減少30天，從而顯著降低經(jīng)血液傳播的 病毒污染血液制品的風(fēng)險2。1人細(xì)小病毒b19人細(xì)小病毒 b19 (human parvovirus b19,簡稱 b19), 最早由cossart于1975年在篩選獻(xiàn)血員乙型肝炎抗原時發(fā) 現(xiàn)，是已知唯一對人類致病的細(xì)小病毒3,病毒無包膜、 耐熱，直徑小(1820 nm),基因組為線性單鏈dna分子， 約5. 5kb,分子量約為5080kd,對稱二十面體4。1. 1人細(xì)小病毒的流行情況普通人群中流行情況：人細(xì)小病毒b19感染非常普遍， 全年

8、均可發(fā)生，但主要發(fā)生在晚冬和早春季節(jié)，該病毒可通 過呼吸道傳播，病毒血癥時血液中b19 dna可到達(dá)1012拷 貝/ml5o大約40%60%的成年人都曾感染過b19病毒，體 內(nèi)出現(xiàn)igg抗體，且igg抗體陽性率隨年齡增長而增長，5 歲以下兒童及20歲以上成人其陽性率分別為2%和49%,在 70歲左右的人群中，80%以上的血清標(biāo)本中存在抗b19 igg 抗體6。在國內(nèi)沒有相關(guān)的流行數(shù)據(jù)報道。獻(xiàn)血員中流行情況：在無償獻(xiàn)血者中病毒血癥的出現(xiàn)頻 率約1/2601/40000,年齡段集中在3545歲之間。其中 陽性捐獻(xiàn)者病毒血癥時病毒載量為2.3x104到6.9x1011 拷貝/ml （約合7. 1x1

9、04到2. lx1012iu/ml）,在急性期過 后的幾個月，少數(shù)甚至幾年后仍有低水平的b19 dna被pcr 檢測到1。女性抗體陽性率高于男性7。且獻(xiàn)血員人細(xì)小 病毒感染率和孕婦感染率比較差異不顯著8。1.2b19病毒感染主要會對以下三類人群造成嚴(yán)重危害：孕婦， 免疫力低下/缺陷的人及兒童。在孕婦病原體感染因素方面, 人細(xì)小病毒b19是除巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、 弓形蟲感染之外造成孕婦自然流產(chǎn)的重要病原體之一，反復(fù) 自然流產(chǎn)孕婦和正常孕婦的流產(chǎn)組織可檢測到b19dnao b19 病毒感染還可以引起兒童的第五病，成人的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎， 溶血貧血患者的再生障礙危象和免疫抑制患者的紅細(xì)胞

10、再 生障礙等疾病912。1. 3 b19病毒對血液制品的威脅盡管人們認(rèn)為b19存活感染期短，高滴度的病毒血癥只 持續(xù)7到10天，然而一個感染者體內(nèi)的低水平病毒量（常 在10, 000100, 000拷貝/ml）可持續(xù)數(shù)月直到病毒被全 清除。并且由于b19病毒直徑小、耐熱、對人群的易感性及 目前滅活/去除血液制品中病毒的s/d法、過濾法和熱處理 法均不能有效的滅活/去除該病毒1316】，使得大多經(jīng)過 分離處理的血漿和終產(chǎn)品仍遭受污染，并常含有較高的病毒 載量，使b19病毒成為血液制品的主要污染病毒之一。b19 病毒dna污染凝血因子訓(xùn)、凝血酶原復(fù)合物、因子vd等血漿 制品的比例分別達(dá)到86.18

11、%、88. 14%和66. 11%17。長期 接受凝血因子類產(chǎn)品（產(chǎn)品中病毒含量大于108 geq/ml時 產(chǎn)生抗體，小于103. 5 geq/ml不產(chǎn)生抗體）治療的患者體 內(nèi)抗b19抗體顯著升高18o大約60%的血漿池包含102到 108genome copy equivalents （lgce 相當(dāng)于 1. 02+0. 13 iu, international units） 19。經(jīng) s/d 處理的血漿仍有 23% 含有b19 dna且滴度高達(dá)106-108 geq/ ml,而混合血漿中 igg滴度約為44iu/ml不足以中和抗原17。目前美國食品 藥品監(jiān)督管理局已規(guī)定對血漿庫進(jìn)行b19病

12、毒dna檢測，對 于b19病毒dna濃度超過104拷貝/ml的血漿庫將廢棄不予 使用，如果高病毒載量的捐贈者血漿在混漿前沒有被及時去 除的話，將會有5%到15%的血漿池不能使用，造成嚴(yán)重?fù)p失 20 o2 b19病毒不同基因型檢測目前把b19病毒分為三種基因型，基因i型，a6和lali （基因ii型）和最先在法國分離出的v9 （基因iii型），其中 基因ii型10.8%的編碼蛋白序列與i型不同21 o在vd1因子 產(chǎn)品中，81%的感染型是基因i型，14%的感染型是基因ii型, 病毒載量分別達(dá)到107和105 geq/mlo不同基因型感染后， 癥狀與宿主先天或后天的體質(zhì)有關(guān)，與基因型無明顯的相關(guān)

13、性，但在檢測方面略有不同，目前已有兩種定性實(shí)時熒光pcr 試劑盒在歐洲商業(yè)化用于血漿檢測,roche lc雖然靈敏度高, 但不能檢測出第ii基因型病毒，而artusb19 pcr試劑盒可 檢測出第ii基因型和代表iii基因型的質(zhì)粒d91. 1，總體來說 b19病毒變異并不多，需擴(kuò)大8倍才能看出來，可被認(rèn)為是 一個少量變異的家族22 o3血制品中b19病毒的去除/滅活血液制品的病毒滅活方法主要有物理法和化學(xué)法。物理法中常用的熱處理法有濕熱法（巴斯德法）、干熱法（6（tc 72 h, 80°c72h）、蒸汽加熱法（將濕潤的凍干產(chǎn)品暴露于60°c、 1119mpa的熱蒸汽中進(jìn)行病

14、毒滅活10h）、納米膜過濾等方法。化學(xué)法中較常用的有低ph法、有機(jī)溶劑/表面活性劑法（s/d 法）等。3. 1傳統(tǒng)病毒滅活工藝：在生產(chǎn)白蛋白的過程中，b19病毒對液體加熱敏感，但在生產(chǎn)靜注免疫球蛋白時，b19病 毒在60%蔗糖濃度下，液體滅活6（tc1小時，并不敏感23； 干熱處理能有效滅活hiv和肝炎病毒，但病毒滅活效果受制 品水份殘留量、配方（如：蛋白質(zhì)、糖、鹽、氨基酸含量） 以及冰凍和凍干時間的影響，同時濕度也會影響b19病毒對 干熱的敏感性，低濕度會加強(qiáng)病毒的抵抗力19, 一般情況 下，干熱處理1, 2和3小時后，病毒感染性分別下降1.5, 2.8, 3.81og,但在有蔗糖存在下，b

15、19病毒就不能被很好的 滅活，如凝血因子制備工藝研究中采用80°c. 72h加熱，該 法能十分有效地滅活hiv和肝炎病毒，但對b19病毒無效； 蒸汽加熱法、s/d、低ph法對無脂包膜病毒滅活效果也不如 對脂包膜病毒滅活效果好，使b19病毒成為血制品的主要污 染病毒。3.2新的病毒滅活工藝3. 2. 1納米膜過濾：納米膜過濾法，與s/d法或低ph 法相結(jié)合可滅活部分對熱穩(wěn)定的無包膜病毒。yokoyama等 24報道b19病毒在0.3m甘氨酸存在，ph6. 2的情況下可形 成聚合體，被35nm濾膜除去7. 51og,而在其他氨基酸，乙 酸鐵或pbs中去除很少，由此推測b19的去除并不是依

16、靠形 成抗原-抗體復(fù)合物，而是甘氨酸使病毒聚合，尺寸變大， 進(jìn)而通過35nm的濾膜被去除。但研究發(fā)現(xiàn)此法應(yīng)用于工業(yè) 生產(chǎn)時膜孔徑大小的穩(wěn)定性不好，且高分子及高粘度制品不 適合用納米膜過濾法2。3. 2.2光化學(xué)法：近年來光化學(xué)滅活法成為對病毒滅活 的研究熱點(diǎn)25,在需滅活的血液制品中加入化學(xué)光敏劑， 光敏劑與病毒dna相結(jié)合，在一定的光輻射劑量下，對病毒 滅活達(dá)到很好的效果。然而病毒滅活后光敏劑的去除及光敏 劑的潛在致畸作用仍是困擾人們的問題。目前亞甲基藍(lán)光化 學(xué)法滅活單份新鮮冰凍血漿已進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段26,但此 法對無包膜病毒效果不好。3. 2.3短波紫外線滅活：紫外線殺菌作用顯著，可使 d

17、na、rna的堿基生成二聚體或加成物而抑制病毒復(fù)制，病毒 下降滴度與光輻射強(qiáng)度及暴露時間有關(guān)。通常，紫外線可分 為3個波段：a波段320380nm (uva), b波段290320nm(uvb), c波段190290nm (uvc),其中短波紫外線uvc對病毒滅活效果最好27 o以前紫外滅活普遍被認(rèn)為對血漿蛋白損傷較大而一度被擱置。最近不斷有研究發(fā)現(xiàn)，在很好的 掌握輻射劑量和暴露時間時，短波紫外線對病毒，尤其是無 包膜病毒可達(dá)到很好的滅活效果，在不加光保護(hù)劑的情況下 對血漿蛋白損傷也不大。j. wang等28報道了 一種新的紫外 滅活儀在短時間內(nèi)就能有效滅活病毒，尤其是無脂包膜病 毒，同時對血

18、漿蛋白不會造成損傷。這種紫外滅活儀設(shè)計的 圍繞燈管的螺旋形結(jié)構(gòu)使血漿料液在壓力泵的推動下形成 渦流29,進(jìn)而使每一部分液體分送速率相同，所受輻射均 勻，從而達(dá)到短的暴露時間，在不需添加任何光保護(hù)劑的情 況下，無包膜病毒b19滅活大于41og值，制品蛋白檢測不 到損傷，蛋白回收率高。本實(shí)驗室研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該紫外滅 活儀對加入無包膜病毒的靜注免疫球蛋白、凝血viii因子和凝血酶原復(fù)合物進(jìn)行90j/m2, 135 j/m2, 200 j/m2等劑 量下的滅活輻射處理，病毒滴度下降達(dá)41og值以上，且處 理后的血液制品蛋白質(zhì)量符合藥典要求。4結(jié)語人細(xì)小病毒b19具有普遍易感性，對免疫力較低的患者 具有

19、潛在的致病威脅，獻(xiàn)血員含病毒的單個單位血漿有使整 個血漿池污染的潛在危險。中和性抗b19抗體可阻止病毒與 細(xì)胞的結(jié)合，但是否具有對b19病毒感染的保護(hù)作用尚不清 楚，需要進(jìn)一步研究。科技進(jìn)步與發(fā)展使生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域日新 月異，對血液中已知和未知病毒的檢測與滅活/去除工藝研 究也不斷深入，以期更大程度上保證患者健康。目前國內(nèi)對 獻(xiàn)血員人細(xì)小病毒檢測并沒有納入法定檢測項目，使血制品 存在安全隱患。基于此，開發(fā)研制出一種新的病毒滅活工藝 迫在眉睫，在眾多滅活病毒機(jī)制中，短波紫外線對無包膜病 毒的滅活優(yōu)勢凸顯出來，有很好的應(yīng)用前景，越來越引起人 們的重視，也為我們提供了新的思路和方法。參考文獻(xiàn)ljhenr

20、iques i, monteiro f, meireles e, et al. prevalence of parvovirus b19 and hepatitis a virus in portuguese blood donors transfusion and apheresis science, 2005,33： 305-309.2 expert committee on biological standardizatiori. guidelines on viral inactivation and removal procedures in tended to assure the

21、 viral safety of huma n blood plasma products， geneva, 2001.3 cossart ye , cant b , field am, et al. parvovirus-like particles in human serum the lancet, 1975,1： 72-73.4 corcoran a, doyle s. advances in the biology,diagnosis and host-pathogen interactions of parvovirus b19. journal of medical microb

22、iology,2004,53:459-475.5 weimer t, streichert s, watson c, et al.high-titer screening pcr： a successful strategy for reducing the parvovirus b19 load in plasma pools for fractionation. transfusion, 2001,41: 1500-1504.6 anderson lj, tsou c , parker ra, et al.detection of antibodies and antigens of hu

23、man parvovirus b19 by enzyme-linked immunosorbent assay. j clin microbiol, 1986,24： 5222- 5261.7 魏強(qiáng)，李巖，王健偉，等吉林省供血者人類細(xì)小病 毒b19 igg抗體的調(diào)查中華實(shí)驗和臨床病毒學(xué)雜志，2006, 20 (2).8 張念華，杜振蘭，趙英會.山東魯西地區(qū)部分獻(xiàn)血員 人細(xì)小病毒b19流行病學(xué)調(diào)查現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009, 36(1).9 tolfvenstam t, papadogiannakis n, norbeck 0, et al. frequency of human parvoviru

24、s b19 infection in intrauterine fetal death. lancet, 2001, 357：1494-1497.10 錢筠，翟艷苓，吳軼蘋.人細(xì)小病毒b19與特發(fā)性 血小板減少性紫瘢.中華實(shí)用診斷與治療雜志,2008,23(1).11 常增民，王清.人細(xì)小病毒b19感染在類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎發(fā)生中的作用齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2007, 22 (6).12 盧銀平，曹偉，洪梅，等.反復(fù)自然流產(chǎn)孕婦流產(chǎn) 組織中人細(xì)小病毒b19的檢測意義.中國計劃生育學(xué)雜志， 2007, 136 (2).13 yunoki m, tsujikawa m, urayama t, etal. he

25、atsensitivity of human parvovirus b19 vox sanguinis, 2003,84： 164-169.14 ros c, baltzer c, mani b, et al. parvovirusuncoating in vitro reveals a mechanism of dna release without capsid disassembly and striking differences in encapsidated dna stability. virology， 2006,345:137-147.15 bliimel j, schmid

26、t i，willkommen h, et al.inactivation of parvovirus b19 during pasteurization of human serum albumin. transfusion, 2002,8 (42)16 blumel j, schmidt i, effenberger w, et al.parvovirus b19 trailsmission by heat-treated clotting factor concentrates. transfusion, 2002,11 (42).17 schmidt i, blumei j, seita

27、 h, et a 1. parvovirus b19 dna in plasma pool and plasm derivatives .vox sanguinis, 2001,81： 228-235.18 baylis sa, shah n, minor pd. evaluation of different assay for the detection of parvovirus b19 dna in human plasma journal of virological methods, 2004, 121： 7-16.19 prikhod ko gg, vasilyeva i, re

28、yes h, et a 1.evaluation of a new lightcycler reverse transcription-polymerase chain reaction infectivity assay for detection of human parvovi- rus b19 in dry-heat inactivation studies. transfusion, 2005,6(45)： 1011-1019.20 thomas i, giambattista d, gerard c, et al.prevalence of human erythrovirus b

29、19 dna in hea1th belgian blood donors and correlation with specific antibodies against structural and non-structu- ral viral proteins. vox sang, 2003,84： 300-307.21 baylis sa. standardization of nucleic acid amplification technique ( nat ) -base assays fordifferent genotypes of parvovirus b19 : a me

30、eting summary. vox sanguinis, 2008,94： 7480.22 cohen bj , candhi j, clewley jp. geneticvariants of parvovirus b19 identified in the united kingdom： implication for diagnostic testing. journal of clinical hrology, 2006,36： 152-155.23 yunoki m, urayama t, tsujikawa m, et al. inactivation of parvovirus b19 by liquid heating incorporated in the manufacturing process of human intravenous immunoglobulin prepa.ra tious. brit ish journal of haematology, 2004, 128： 401-404.24 bonvicini f, gallinella g, gentilomi ga, et al. prevention of iatrogenic