PAS染色顯示細胞中多糖成分

1、糖原的顯色pas反應（periodic acid schiff reaction） 任子健一、制片技術n生物體的組織細胞大部分都是不透明的，不能直接在顯微鏡下觀察，需要切成薄片，必須采用各種特殊的方法對材料進行處理，把材料制成薄片標本，經過染色后，置于顯微鏡下觀察它們的微細結構。石蠟切片n石蠟切片法是組織學常規(guī)制片技術中應用最廣泛的一種方法，是以石蠟作包埋劑，用旋轉切片機將標本切成薄片，經一系列處理制成永久切片。n制作過程：1.取材2.固定3.洗滌4.脫水5.透明6.浸蠟7.包埋8.切片9.貼片10.脫蠟復水11.染色12.脫水13.透明14.封片。1.取材n從人或動物體內取下所需組織或器官，

2、材料必須新鮮，組織塊不宜太大，以便固定劑穿透。2. 固定n目的：迅速凝固蛋白質，終止細胞一切代謝過程，防止組織自溶，保持其活體時結構。n固定劑：10%甲醛、80%酒精、混合固定劑（bouin氏液、faa液、carnoy氏液）。n用量：必須充足，一般為材料塊的2030倍。n固定時間：數小時至24小時。3. 洗滌n目的：除去留在組織內的固定液及其結晶沉淀，以免影響后面的染色效果。n方法：多數用流水沖洗，少數用酒精。4.脫水 n目的：固定或洗滌后的組織內充滿水分，而水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去，才能進行石蠟包埋。n脫水劑：酒精n方法：從低濃度到高濃度梯度酒精脫水：30%50%70%8

3、0%90%95%100%各級酒精中放置1數小時。 水 酒精 石蠟5.透明n目的：酒精與石蠟不相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內的酒精。組織在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，因此該過程稱透明。n透明劑：二甲苯。n方法：酒精二甲苯等量混合液（1：1）15分鐘，二甲苯30分鐘。 水酒精二甲苯石蠟6.浸蠟n目的：除去組織中的透明劑，使石蠟滲透到組織內部，達到飽和程度以便包埋。n方法：石蠟二甲苯等量混合15分鐘，石蠟、石蠟 各30分鐘。浸蠟應在高于石蠟熔點3左右的溫箱中進行，以利石蠟浸入組織內（石蠟的熔點在5060之間）。7.包埋n目的：將浸蠟后的組織塊包埋于石蠟中。n方法：取出組織塊

4、，置于盛有融化石蠟的包埋框中，迅速放入冷水中冷卻，待石蠟完全凝固（約30min）后取出，即做成含有組織塊的蠟塊標本。8.切片 n將蠟塊裝在切片機上，調整所需的切片厚度（410um），進行切片，切出一片接一片的蠟帶，用刀片割開蠟帶。9.貼片 n目的：借助粘附劑將展平的蠟片粘附于載玻片上，以免在以后的操作步驟中脫落。n方法：在潔凈的載玻片上涂抹薄層粘附劑（如多聚賴氨酸），滴兩滴蒸餾水于載玻片上，把蠟片放于水滴上，略加溫使蠟片鋪展，將載玻片放入溫箱中干燥。10.脫蠟復水 n目的：染色液多數為水溶液，因此染色前必須將組織中的蠟脫去，才能進行染色。n方法：與脫水浸蠟過程正好相反： 二甲苯、30min10

5、0%酒精90%酒精80%酒精70%酒精蒸餾水 各2min。 石蠟二甲苯酒精水11.染色 n目的：使細胞組織內的不同結構呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察。n經典的he染色法： 蘇木精（hematoxylin） 伊紅（eosin） 堿性染料 酸性染料 細胞核中的dna、rna等 細胞質、膜性結構等嗜堿性物質（本身酸性） 嗜酸性物質（本身堿性） 染成藍色 染成紅色12.脫水 13.透明 14. 封片 n目的：去除水分，透明組織，便于觀察和長期保存標本。n方法： 脫水：95%酒精 2分鐘100%酒精 2分鐘 透明：二甲苯i 2分鐘二甲苯ii 2分鐘 封片：將載玻片從二甲苯中取出放在吸水紙，迅速地在切片的中間滴

6、一滴中性樹膠，拿起蓋玻片，緩慢傾斜放下，避免產生氣泡。取材固定脫水、透明浸蠟、包埋、切片、貼片脫蠟復水染色脫水、透明封片smear stretched preparation ground section 其他制片技術涂片(smear) 鋪片(stretched preparation) 磨片(ground section)二、組織化學技術（histochemistry）n組織化學和細胞化學技術是應用化學反應與物理反應原理檢測組織或細胞內某種化學成分，并進行定位、定量及相關功能研究的一種實驗技術。n例如糖類、脂類、酶、核酸等可與試劑發(fā)生化學、物理反應，形成有色的終末產物。 過碘酸過碘酸-sch

7、iff反應反應（ periodic acid schiff reaction , pas反應）反應）n原理：原理：pas反應是經典的組織化學方法，用來顯示組織細胞中的多糖或糖蛋白。原理是含有乙二醇基的糖類，在過碘酸的作用下，經氧化而產生雙醛基，醛基進而與亞硫酸品紅（schiff試劑）結合，使無色液體變成紫紅色染料，并沉著于含有多糖或糖蛋白的細胞或組織結構上。乙二醇乙二醇pa氧化氧化醛基醛基schiff試劑試劑紫紅色沉淀紫紅色沉淀（pas陽性反應）陽性反應）糖原的顯色糖原的顯色pas反應反應n應用：應用：可根據紫紅色的位置及深淺鑒定糖成分的分布及相對含量，用于心血管疾病、糖尿病以及某些腫瘤的診斷

8、和研究。腎小球糖尿病腎病pas染色 小腸上皮 三、免疫組織化學三、免疫組織化學（immunohistochemistry） 利用抗原（利用抗原（antigen, ag），抗體（），抗體（antibody）特異）特異 結合的原理，用已知抗體檢測未知抗原的一種方法。結合的原理，用已知抗體檢測未知抗原的一種方法。標記物為熒光素、過標記物為熒光素、過氧化物酶或金顆粒氧化物酶或金顆粒糖原的顯色糖原的顯色pas反應反應材料：材料：n標本：成年小鼠肝和脾石蠟切片n試劑：1%過碘酸，蒸餾水，亞硫酸品紅溶液（schiff試劑），0.5%偏重亞硫酸鈉，蘇木精，二甲苯，梯度酒精，中性樹膠。n器材：染色缸，燒杯，切片

9、架，蓋玻片等。 方法：方法：3.過碘酸氧化10分鐘4.蒸餾水洗3分鐘5.schiff試劑避光染色10分鐘6. 0.5%偏重亞硫酸鈉溶液浸洗3次（i、ii、iii）， 每次2分鐘7.自來水洗3次，每次1分鐘，蒸餾水洗1分鐘8.蘇木精染色1分30秒9.自來水洗3次，每次1分鐘，蒸餾水洗1分鐘10.梯度脫水：95%酒精 2分鐘100%酒精 2分鐘， 透明： 二甲苯i 2分鐘二甲苯ii 2分鐘11.中性樹膠封片，顯微鏡下觀察（低倍鏡高倍鏡）*兩人一小組，分別 觀察肝和脾切片注意事項：注意事項：1.從前一個缸放入后一個缸之前，要盡量瀝干水。2.自來水洗滌方法：將切片架放入洗滌缸中，上下左右晃動洗滌，切不可對著自來水沖洗。3.嚴格控制好染色、