內(nèi)生細菌提高向日葵幼苗在水分脅迫條件下的生長能力,產(chǎn)生水楊酸,并抑制病原菌生長

1、內(nèi)生細菌提高向日葵幼苗在水分脅迫條件下的生長能力，產(chǎn)生水楊酸，并抑制病原菌生長摘要從灌溉或干旱條件下選擇植物生長促生菌（PGPB）的內(nèi)生細菌菌株SF2（與木糖氧化無色桿菌99.9%同源）和SF、SF4（與短小芽孢桿菌99%同源）。本研究旨在討論水脅迫條件下栽種的向日葵接種SF2、SF3、SF4，來評估這些菌株在控制介質(zhì)或在WA=20.3MPa條件下水楊酸（SA）的產(chǎn)生 ，分析外源水楊酸、茉莉酸(JA)、細菌顆粒和細菌培養(yǎng)上清對病原真菌鏈格孢、菌核菌和黃藻生長的影響。通過兩個自交系來研究細菌接種的生長反應(yīng)（水分脅迫敏感B59和水脅迫B71）和商業(yè)混合帕萊索24。水分脅迫和正常條件下，植物生長后接

2、種對于帕萊索24和水分脅迫敏感B59比水脅迫B71增強更強烈。所有3個菌株在控制介質(zhì)中生產(chǎn)水楊酸（SA）的能力SF3、SF4較SF2高。水楊酸的生產(chǎn)顯著高于WA=2.03MPA。外源水楊酸和茉莉酸導(dǎo)致了菌核病生長的顯著降低，輕微降低了鏈格孢和輪枝菌的生長。真菌的生長相較于細菌上清液被細菌顆粒更加強烈的影響。我們的研究表明，在水脅迫條件下，這些內(nèi)生菌能夠顯著提高向日葵幼苗的生長能力，產(chǎn)生水楊酸，并抑制病原真菌。這些特性對于制定提高向日葵生長及作物產(chǎn)量的菌劑配方非常有用?？s寫JA 茉莉酸 PGPB 植物生長促生菌 SA 水楊酸引言向日葵是全世界內(nèi)被廣泛種植的油料作物?？偟膩碚f，向日葵的栽種面積因其

3、適度的栽培需要和高產(chǎn)油量而穩(wěn)步增加。在阿根廷，向日葵種植的潛在地區(qū)從北部的查科拓展到南部的潘帕斯草原。向日葵經(jīng)常暴露在該地區(qū)的干旱期，越向西干旱期越長。大豆種植的擴增近年來已經(jīng)影響到了其他作物的種植面積，向日葵也被置換到了邊遠地區(qū)。對于向日葵來說，由于惡劣的氣候和土壤條件，一個高收益和生產(chǎn)的主要障礙就是缺乏同步周期的作物。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，微生物的應(yīng)用對于減少化學(xué)肥料的使用非常重要。接種細菌可以促進植物的生長，加速種子的萌發(fā)，抑制植物病蟲害，提高出苗率，更好的應(yīng)對外部威脅，并改變根的生長模式。一個可能的策略來幫助植物處理環(huán)境壓力就是在植物的根際土壤中引入益生細菌。在某些情況下，這些細菌可以規(guī)范和提

4、高植物的性能來應(yīng)對環(huán)境壓力，從而保持或提高產(chǎn)量。這種方法提高了仙人掌和長春花在水分脅迫條件下的生長。在長期脅迫條件下與植物相聯(lián)系的細菌生長與植物共同進化，并為植物提供了顯著的收益。這些可能會在根際、根部表面或土壤中自由生長的微生物，被稱為植物生長促生菌（PGPB）。植物生長促生菌在以下幾個方面促進植物的生長：（一）直接提高植物的代謝，短時間內(nèi)的供應(yīng)來增加物質(zhì)水平，例如，固定大氣中的氮，溶解磷鐵，或增強植物激素的生產(chǎn)；（二）提高植物對環(huán)境脅迫如干旱、鹽堿的耐受性;（三）通過減輕影響植物生長的細菌、真菌、線蟲和病毒來間接促進。不同的細菌（包括無色桿菌屬、固氮螺菌、芽孢桿菌、假單胞菌屬和根瘤菌）都被

5、證明有植物生長促生菌的功效。嘗試在農(nóng)業(yè)作物的根際土壤中引入有益的細菌一般都遇到了不同程度的失敗，主要的困難時將野生種定植于已經(jīng)馴化了的微生物群落。通常情況下，從一種特定的植物根際分離的包含高效基因型的土生菌種來促進植物生長和執(zhí)行這些功能比外來物種更好。病原真菌，尤其是鏈格孢屬、核盤菌、黃萎病菌，對阿根廷向日葵造成了非常嚴重的經(jīng)濟損失。鏈格孢產(chǎn)生黑褐色斑點的葉子，病變的部分聯(lián)合，導(dǎo)致葉片的枯萎。莖部的病變從狹窄深色的斑點擴大。這些病變部位合并，形成大的斷裂的黑色區(qū)域，導(dǎo)致莖部破損。菌核在土壤中或植物碎片中越冬。當它們接觸到向日葵根部時，菌核發(fā)芽。幸存的向日葵可能會小于正常的植株，并且有可能不產(chǎn)生

6、種子。癥狀是葉片突然枯萎，根部腐爛，莖部潰瘍，在向日葵干部產(chǎn)生菌核。棉花黃萎病菌感染的最初癥狀是壞死的葉片區(qū)域有枯萎黃邊，并且總是從葉片的底部向上部蔓延。受影響的葉片很快會完全干枯，在莖部的界面，維管系是棕色的，在可見光下可看到一個棕色環(huán)。報告顯示，幾種植物激素（包括水楊酸和茉莉酸）都具有抗真菌活性。例如，水楊酸減少菌絲的生長和尖孢鐮刀菌的數(shù)量;茉莉酸抑制稻瘟病菌孢子的萌發(fā)和大麥白粉菌附著胞的分化。在此前的一份研究中，我們從向日葵在灌溉或干旱條件下生長營養(yǎng)階段的結(jié)束時期從土壤中分離出大量的菌株。在固氮能力，溶磷能力，蛋白水解和纖維素酶活性，抑制病原真菌和生產(chǎn)JA、脫落酸能力的基礎(chǔ)上篩選出三個菌

7、株，被鑒定為芽孢桿菌屬（SF3和SF4）、無色桿菌屬(SF2)。在本研究中，我們研究了（一）將SF2，SF3，SF4菌株接種于自交系向日葵系B59（對水分脅迫敏感），B7-l（寬容的水應(yīng)力），和商業(yè)混合帕萊索24，來研究在水分脅迫條件下幼苗的生長能力；（二）在正常和脅迫條件下SF2，SF3，SF4生產(chǎn)水楊酸的能力：（三）菌株培養(yǎng)液離心沉淀和上清液對生長著的病原真菌（鏈格孢屬、核盤菌、黃萎病菌）的抑菌能力（四）在生長著的真菌上施加外源水楊酸和茉莉酸的影響材料與方法接種程序和植物生長自交系向日葵B59和B71，由阿根廷國家農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所（INTA）培育而成，特征分別為對水分敏感型和耐水分脅迫型。商

8、業(yè)混合帕萊索24進行接種試驗。5粒種子被放置于包含無菌蛭石的罐子里，放置于一個16小時光照（28C）/8小時暗（20C）的光周期室內(nèi)。第四天，幼苗分別接種SF2、SF3、SF4（108 CFU ml-1），1mlLB培養(yǎng)基添加到未接種的幼苗上（對照），幼苗通過毛細管虹吸蒸餾水澆灌。一組接種的幼苗用半強度的霍格蘭溶液澆灌。其它兩組用6000濃度的聚乙二醇來產(chǎn)生Wa=-048和Wa=-0.96與半強度的霍格蘭溶液混合澆灌。接種后的第14天，收獲種苗。記錄根和莖的干物質(zhì)（DM）的值。每一組實驗的每一個處理都設(shè)置了4個重復(fù)，得到4個重復(fù)的實驗結(jié)果。水楊酸（SA）的評價從用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的穩(wěn)定期的細菌菌

9、株中選出25ml（96h）（細胞密度為1010 CFU ml-1）或選用13.7%聚乙二醇6000（WA =-2.03 MPa）培養(yǎng)的菌體（細胞密度為108 CFU ml-1），用于SA測定。25ml不含有細菌的LB培養(yǎng)基（WA = -1.12 MPa）作為對照。將它們以8000 rpm離心，4 C，20分鐘。取兩毫升的上清液過濾和用鹽酸酸化至ph2.5。以50納克為標準添加(2H4)-SA。每個樣品均分兩步進行2ml乙酸乙酯添加和蒸干。將殘渣用50II甲醇溶解，每10II注入LC-MS/MS。實驗設(shè)置5

10、個重復(fù)。高效液相色譜法使用聯(lián)盟2695（分離模塊，沃特斯，美國）配備自動取樣器的四元泵來執(zhí)行分析。Restek C18（Restek，USA）柱（2.1 9 100毫米，5Im）在28C注射10II體積使用。二元溶劑系統(tǒng)用于以200IImin-1的恒定流速梯度洗脫0.2%醋酸的水（溶劑B）和甲醇（溶劑A）。將溶劑A用以下的比例線性梯度（V/V）t (min), % A:(0, 40), (25, 80),再平衡7min。質(zhì)譜法MS/MS實驗在Micromass Quatro UltimaTM PT雙四級質(zhì)譜儀（micromass，曼城，英國）上進行，所有對水楊酸的分析都使用

11、渦輪離子噴霧源在負離子模式下進行如下設(shè)置，雙毛細管電壓V  3000，能量35 V錐，射頻lens1（20），射頻lens2（0-3）源的溫度- 100C，溶劑溫度 380 C，氣錐100Ih-1，氣體溶劑701Ih-1，碰撞（50），乘（650）。MS/MS試驗參數(shù)的優(yōu)化使用在A/B (40:60, v/v).流動相中稀釋為濃度為10納克II-1個人的水楊酸標準溶液。MS/MS產(chǎn)物離子通過在雙四極質(zhì)譜計的碰撞細胞中選定的前體離子碰撞活化解離產(chǎn)生，質(zhì)量用儀器的第二分析儀分析。在負離子模式下，用去質(zhì)子化的分子MH-做水楊酸譜。由于許多化合物可能存在相同的標

12、稱分子量，通過注射樣品的多反應(yīng)檢測（MRM）就行定量。用源質(zhì)量或獨特碎片離子的結(jié)合來檢測水楊酸在細菌培養(yǎng)液中的使用。每個過度停留1000毫秒，通過監(jiān)測水楊酸（2H4）-SA(內(nèi)部標準)的137/93和141/97的躍遷來監(jiān)測MRM的采集。病原真菌的生長試驗之前的研究發(fā)現(xiàn)，某些細菌能夠抑制植物病原真菌的活性。我們通過研究鏈格孢、核盤菌和黃萎病菌的生長來研究細菌沉淀和上清液對其的影響。通過對研究水楊酸和茉莉酸對油菜核盤菌的影響進行測試。為了獲得菌株SF2、SF3和SF4的顆粒和澄清液，對在指數(shù)生長期的20ml各菌種進行在4C條件下8000轉(zhuǎn)離心20min，在25HZ條件下超聲處理10min，在20

13、C條件下凍結(jié)30min，解凍。在含有麥芽提取物的瓊脂平板上，每一種真菌菌絲顆粒都在進行蔓延。分別對細菌澄清液1ml，水楊酸（4pmolml-1），或茉莉酸（2pmolml1）在37C生物麥芽提取物無菌瓊脂轉(zhuǎn)移平板進行電容測定。真菌的菌絲體在25C條件下平板之間培養(yǎng)7天（直徑1cm），用水楊酸、茉莉酸和上清液作為對照組，沒有含有真菌菌絲體的顆粒。對菌絲生長的抑制(%）作用的計算公式為I = (C - T)/C 9100, 控制C菌絲和T菌絲在每個平板的直徑，實驗設(shè)置六個重復(fù)。統(tǒng)計分析在水楊酸水平對抗真菌的效果進行對根和莖DM的進行統(tǒng)計測試水平的方差分析，并對數(shù)據(jù)進行事后多重范圍試驗。使用非參數(shù)檢

14、驗（KruskalWallis）來檢測細菌顆粒對黃萎病的效果（圖6）和水楊酸/茉莉酸對鏈格孢和核盤菌的影響（圖5a，b），使用軟件為Statgraphics Plus, v.3 (Manugistics,Rockville, MD, USA).。結(jié)果正常條件下和水分脅迫條件下幼苗接種SF2、SF3、SF4的效果在有無接種菌株的條件下監(jiān)測不同基因型的向日葵對水分脅迫敏感度的反應(yīng)，評估脅迫對根與芽影響的早期植物響應(yīng)。在正常生長條件下(Wa = -0.2 MPa)，三株菌株都接種的商業(yè)混合帕萊索24幼苗干物質(zhì)均有增加(Fig. 1a)。在Wa = -0.48 MPa，與未接種菌株的種苗相對比，SF3

15、和SF4接種的芽干物質(zhì)分別增加了1.29倍和1.43倍（圖1b）。在 Wa = -0.96 MPa，接種任意3株菌株的芽的干物質(zhì)都只是有少量的增加。在Wa =-0.2 MPa，接種SF3幼苗的根部干物質(zhì)顯著增加而接種SF2和SF4增加程度較?。▓D1d）。在適度的脅迫條件下(Wa = -0.48 MPa)，SF3和SF4增加了根部的干物質(zhì)。在嚴重脅迫條件下(Wa =-0.96 MPa),三株菌株均能顯著增加根部的干物質(zhì)（圖1f）圖1正常生長和水分脅迫條件下，商業(yè)混合帕萊索24幼苗接種菌株對芽和根干物質(zhì)的影響（N為未接種，每個實驗包括4個重復(fù)，去除結(jié)果顯著不同的幼苗）圖2在正常和脅迫條件下生長的抗

16、逆性基因型B71接種細菌對植物根和芽干物質(zhì)的影響 符號和實驗設(shè)計如圖1所示接種了3株菌株的水分脅迫抗性基因型B71顯著增加了芽在脅迫和水分正常條件下的干物質(zhì)（圖2a-c）。根部干物質(zhì)的增加也與之相似（圖2d-f）。在嚴重脅迫條件下，只有SF2菌株沒有增加根部的干物質(zhì)（圖2f）對于水分脅迫敏感型基因型B59，SF2和SF3增加了芽在正常生長條件下的干物質(zhì)(圖3a)。在適度脅迫條件下，SF3和SF4（尤其是SF4），與接種SF2相比能顯著增加芽的干物質(zhì)（圖3b）。相反的，在嚴重脅迫條件下，接種菌株的向日葵幼苗干物質(zhì)不受影響。在正常生長條件下，接種細菌也沒有明顯植物根部的干物質(zhì)(圖3)。在適度脅迫條

17、件下，接種3種菌株的植物根部干物質(zhì)顯著增加（圖3e）。在嚴重脅迫條件下，接種SF3也能輕微增加其根部干物質(zhì)（圖3f）。圖3在正常和脅迫條件下生長的水分敏感型基因型B59接種細菌對植物根和芽干物質(zhì)的影響 符號和實驗設(shè)計如圖1所示利用細菌生產(chǎn)水楊酸在72h菌株培養(yǎng)達到穩(wěn)定時，測量細菌生產(chǎn)水楊酸的量。在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)SF2、SF3、SF4 (Wa = -1.12 MPa)。在聚乙二醇存在的條件下，產(chǎn)生-2.03MPa的水勢來進行激素評價。在LB培養(yǎng)基中，Wa=-1.12MPa條件下，SF3和SF4產(chǎn)生大量的水楊酸。SF2生產(chǎn)的水楊酸含量(16 pmol ml-1)低于SF3 (238 pmol m

18、l-1)和SF4 (270 pmol ml-1)。在水分脅迫條件下(Wa = -2.03 MPa)，3株細菌生產(chǎn)水楊酸的能力均顯著增加（圖4）。圖4 在LB培養(yǎng)基（WA = -1.12 MPa）和LB與PEG混合培養(yǎng)基（WA = -2.03 MPa）上生長的SF2、SF3、SF4菌株發(fā)酵生產(chǎn)水楊酸實驗設(shè)置5個重復(fù)。值表示不同字母表示在0.05差異顯著P水楊酸、茉莉酸、細菌顆粒和細菌上清液對病原真菌生長的影響外源添加水楊酸或茉莉酸減少鏈格孢13%的生長（圖5A），也減少了黃屬類似的生長量（圖5C）。兩種激素對核盤菌的生長產(chǎn)生了更大程度的

19、下降：24%由水楊酸，17%由茉莉酸（圖5B）。圖5 外源水楊酸和茉莉酸對向日葵內(nèi)病原真菌的影響a鏈格孢菌 b核盤菌 c黃萎病菌 值表示不同字母表示在0.05差異顯著P三株菌株的上清液均能少量降低鏈格孢（圖6a）和黃屬（圖6c）真菌的增長。核盤菌的生長受到SF2上清43%抑制，SF3上清33%抑制，SF4上清22%抑制（圖6b）。三株菌株顆粒抑制鏈格孢生長的程度類似：52%-53%(圖6D)。核盤菌生長被SF4顆粒58%抑制，被SF3顆粒52%抑制，被SF2顆粒50%抑制（圖6c）。黃屬的生長被SF2顆粒57%抑制，被SF4顆粒54%抑制，被SF3顆粒47%抑制（圖6f）。圖6 SF2、SF3

20、、SF4細菌上清液和細菌顆粒對病原真菌生長效果的影響a-c 細菌上清液 d-f細菌顆粒 值表示不同字母表示在0.05差異顯著P因此，細菌顆粒對病原真菌的抑制作用大大高于細菌上清液或水楊酸、茉莉酸。討論作物的生產(chǎn)和產(chǎn)量對眾多的環(huán)境脅迫因素非常敏感。保存和提高植物產(chǎn)量的一個重要戰(zhàn)略是在植物的根際土壤中接種益生菌來幫助提高抗逆性。例如在玉米種接種巨大芽孢桿菌，能夠提升營養(yǎng)同化，尤其是對氮磷鉀的同化。對麻風(fēng)樹的種子（巴巴多斯堅果）接種芽孢桿菌，能夠非常明顯的改進幼苗各項指標的活力。在我們試驗中使用的各種基因型向日葵，水分脅迫并未對未接種菌株的商業(yè)混合帕萊索24和耐旱自交系B71莖或根的生物量造成顯著的

21、減少。這種現(xiàn)象可能主要與他們的耐水基因型的能力有關(guān)。相反的，在菌株存在的情況下，受水分脅迫的敏感型基因型B59植株根系生物量急劇增加，可能是他能夠提高水分的吸收。在嚴重環(huán)境脅迫條件下，芽孢桿菌（菌株SF3和SF4）和無色桿菌（菌株SF2）能夠明顯增加向日葵幼苗根上部和根系干物質(zhì)的生長。輕度水分脅迫條件下,SF3和SF4增加帕萊索24芽和根的干物質(zhì)，而SF2對此沒有影響。在嚴重水分脅迫條件下，所有三個菌株對帕萊索24和B71的生長均有促進作用（除了SF2值對B71根部干物質(zhì)無明顯影響），SF2和SF4不能改變重度水分脅迫對壓力敏感自交系B59的效果。總之，這些研究結(jié)果表明，與無色桿菌相比，芽孢桿

22、菌屬能夠更有效地幫助向日葵幼苗來適應(yīng)水分脅迫。觀察向日葵3種基因型接種SF2、SF3、SF4的差異。在水分脅迫條件下和正常條件下，帕萊索24和B71接種細菌的效果最好。接種細菌的帕萊索24和B71在水分脅迫條件下根部干物質(zhì)的增加可能是由于其能夠促進向日葵幼苗對土壤中水分的吸收。給B59接種后，只有在輕度水分脅迫條件下芽和根的干物質(zhì)有所增加。與帕萊索24和B71相比，B59所觀測到的不同的結(jié)果被認定是不同植物基因型對細菌菌株的影響。這可能是由于這些細菌通過促進向日葵產(chǎn)生的具體激素來促進其生產(chǎn)的增長。短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌已經(jīng)被證明能夠大量促進生長素和赤霉素的產(chǎn)生。短小芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌能

23、夠促進紅辣椒幼苗的增長。SF2、SF3和SF4能夠增強其它生長調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)（例如茉莉酸、脫落酸），同樣能夠提升植物對抗土壤脅迫條件的能力。已知以下幾個屬的細菌，包括假單胞菌能夠合成水楊酸。我們可以考慮使用向日葵內(nèi)生菌SF2、SF3和SF4合成水楊酸的能力，在LB培養(yǎng)基中（Wa=-1.12MPa）。在水分脅迫條件下（Wa=-2.03Mpa），能夠增加水楊酸的生產(chǎn)。通過細菌合成水楊酸不僅在植物抵抗病原體感染，也在調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫反應(yīng)，都發(fā)揮了重要的作用。若菌株失去了產(chǎn)生水楊酸的能力，那它們促進植物產(chǎn)生抗病性也會喪失。外源水楊酸的添加導(dǎo)致鏈格孢屬、核盤菌和黃萎病病菌8%-17%的抑制作用。這表明有其它的化合物與水