園藝植物生物技術(shù)—第七章

1、第七章第七章 植物基因工程的基礎(chǔ)知識植物基因工程的基礎(chǔ)知識與技術(shù)與技術(shù) 李李 英英(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院)Tel生科樓生科樓B6018E-mail:課程主要內(nèi)容第一章 緒論第二章第二章 園藝植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)園藝植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)第三章第三章 園藝植物脫毒與離體快速繁殖園藝植物脫毒與離體快速繁殖第四章第四章 園藝植物種質(zhì)離體保存與無性變異系篩選園藝植物種質(zhì)離體保存與無性變異系篩選第五章第五章 園藝植物的細胞工程園藝植物的細胞工程第六章第六章 園藝植物的染色體工程園藝植物的染色體工程第七章 植物

2、基因工程的基礎(chǔ)知識與技術(shù)第八章 園藝植物基因的分離與克隆第九章 園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建第十章 園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化第十一章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在園藝植物育種的應(yīng)用第十二章 園藝植物的分子標(biāo)記第十三章 園藝植物生物信息學(xué)第十四章 園藝植物生物技術(shù)的安全性評價與管理授課教師授課教師: :李英李英, ,王建軍王建軍, ,侯喜林侯喜林 基因工程基因工程是將外源基因外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達的系列操作技術(shù)總稱。 外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。 這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別

3、于其它技術(shù)的根本特征。第七章第七章 植物基因工程的基礎(chǔ)知識與技術(shù)植物基因工程的基礎(chǔ)知識與技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識第二節(jié)第二節(jié) 植物基因工程常用的工具酶植物基因工程常用的工具酶第三節(jié)第三節(jié) 植物基因工程常用的載體植物基因工程常用的載體第四節(jié)第四節(jié) 植物基因工程的基本技術(shù)植物基因工程的基本技術(shù) 第一節(jié) 植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識 核酸：是以核苷酸為基本單位組成的生物大分子。DNA, RNA 核苷酸: 堿基，戊糖，磷酸 A,T,G,C; A,U,G,C -D-2脫氧核糖遺傳物質(zhì)？遺傳物質(zhì)？第一節(jié) 植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識 DNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能 RNA的結(jié)構(gòu)與

4、功能的結(jié)構(gòu)與功能 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 遺傳信息的傳遞遺傳信息的傳遞 基因的概念基因的概念一、一、DNADNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能？ DNA的一級結(jié)構(gòu)的一級結(jié)構(gòu) 指DNA分子中脫氧核苷酸按照一定的排列順序，通過磷酸二脂鍵連接形成的多核苷酸。又稱堿基順序。 DNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) 即雙螺旋結(jié)構(gòu)。 DNA的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu) DNA雙螺旋進一步扭結(jié)、折疊形成的更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)稱為DNA三級結(jié)構(gòu)，這種雙螺旋結(jié)構(gòu)可再次螺旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)。生物的遺傳信息儲存于生物的遺傳信息儲存于DNA的核苷酸序列中，生物界物種的多的核苷酸序列中，生物界物種的多樣性就在于樣性就在于DNA分子分子4種

5、核苷酸千變?nèi)f化。種核苷酸千變?nèi)f化。DNA ModelDNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA分子在水性環(huán)境和生理條件下最穩(wěn)定的分子在水性環(huán)境和生理條件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但并不是不變的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強度或相對濕度時，結(jié)構(gòu)，但并不是不變的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強度或相對濕度時， DNA結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的存在可能有兩方面的生物學(xué)意義，一方面，超螺旋結(jié)構(gòu)的存在可能有兩方面的生物學(xué)意義，一方面， DNA雙鏈雙鏈經(jīng)過盤繞壓縮使松弛性經(jīng)過盤繞壓縮使松弛性DNA更為緊密，體積更小，更能保持穩(wěn)定。另一更為緊密，體積更小，更能保持穩(wěn)定。另一方面，影響方面，影響D

6、NA雙螺旋的解鏈過程，從而影響與其他大分子如蛋白質(zhì)、雙螺旋的解鏈過程，從而影響與其他大分子如蛋白質(zhì)、酶的結(jié)合。酶的結(jié)合。二、二、 RNARNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能 mRNA mRNA存在于細胞質(zhì)中，直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。 tRNA tRNA是細胞內(nèi)分子質(zhì)量最小的一類核酸，由70120核苷酸構(gòu)成。 rRNA 是最多的一類RNA，也是3類RNA中相對分子質(zhì)量最大的一類RNA，它與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成核糖體，其功能是作為mRNA的支架，使mRNA分子在其上展開，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的合成。rRNA單獨存在時不執(zhí)行其功能，它與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機”。 三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能三、蛋

7、白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)由氨基酸通過肽鍵連接成一條多肽鏈，由一個氨基酸的羥基和另一個氨基酸的氨基進行縮合反應(yīng)產(chǎn)生。 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)指多肽采取的不同構(gòu)象。兩種主要形式是螺旋和折疊，二者都由多肽的不同氨基酸之間形成的氫鍵所穩(wěn)定。 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)指將多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)組分折疊成為三維構(gòu)型而形成的。主要被氫鍵、二硫鍵和疏水作用所穩(wěn)定。 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 即兩條或更多已形成三級結(jié)構(gòu)的多肽鍵組合在一起形成一個多亞基蛋白。不是所有蛋白都有四級結(jié)構(gòu)。定義：定義：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序

8、。的排列順序。1.1.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)主要化學(xué)鍵：主要化學(xué)鍵：肽鍵肽鍵二硫鍵二硫鍵的位置屬于一級結(jié)構(gòu)研究范疇。的位置屬于一級結(jié)構(gòu)研究范疇。 一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。物學(xué)功能的基礎(chǔ)。胰島素的一級結(jié)構(gòu)胰島素的一級結(jié)構(gòu)30212.2.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象的構(gòu)象 。定義：定義：穩(wěn)定因素穩(wěn)定因素： 氫鍵氫鍵 （一）肽單元（

9、一）肽單元 (peptide unit) 參與組成肽鍵的參與組成肽鍵的6個原子位于同一平面，個原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質(zhì)構(gòu)又叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質(zhì)構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位。象的基本結(jié)構(gòu)單位。肽單元肽單元RCCCOORNCN肽單元肽單元HHHH 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式 -螺旋螺旋 ( -helix ) -折疊折疊 ( -pleated sheet ) -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角 ( -turn ) 無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲 ( random coil ) （二）（二） -螺旋螺旋: 多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋右手螺旋，側(cè)鏈側(cè)鏈伸向螺旋

10、外側(cè)。伸向螺旋外側(cè)。 每圈螺旋含每圈螺旋含3.6個氨基酸個氨基酸，螺距為，螺距為0.54nm。 每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵氫鍵與螺旋長軸基本平與螺旋長軸基本平行。行。（三）（三） - -折疊折疊多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈位于鋸齒結(jié)構(gòu)的上下方。齒狀結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈位于鋸齒結(jié)構(gòu)的上下方。 兩段以上的兩段以上的 -折疊結(jié)構(gòu)平行排列折疊結(jié)構(gòu)平行排列 ，兩鏈間可，兩鏈間可順向平行，也可反向平行順向平行，也可反向平行 。兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固

11、兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固 -折疊折疊結(jié)構(gòu)。氫鍵與螺旋長軸垂直。結(jié)構(gòu)。氫鍵與螺旋長軸垂直。 （四）（四） - -轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲 - -轉(zhuǎn)角：轉(zhuǎn)角：無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結(jié)構(gòu)。無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結(jié)構(gòu)。 肽鏈內(nèi)形成肽鏈內(nèi)形成180180回折?；卣邸：? 4個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵。第四個形成氫鍵。 第二個氨基酸殘基常為第二個氨基酸殘基常為ProPro。 - -轉(zhuǎn)角：轉(zhuǎn)角：（五）模體（五）模體蛋白質(zhì)分子中，二個或三個具有二蛋白質(zhì)分子中，二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間

12、上相互接近，形成一個具有特殊功能的空間構(gòu)象，被稱成一個具有特殊功能的空間構(gòu)象，被稱為模體為模體(motif)。螺旋環(huán)螺旋螺旋環(huán)螺旋 鋅指鋅指3.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der WaalsVan der Waals力等。力等。 穩(wěn)定因素：穩(wěn)定因素：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。定義定義 肌紅蛋白肌紅蛋白 (Mb) N 端端 C端端纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域 (domain) 大分子蛋

13、白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)常可分割成一個或大分子蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域。行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域Triose phosphate isomerase亞基之間的結(jié)合力主要是亞基之間的結(jié)合力主要是氫鍵和離子鍵。氫鍵和離子鍵。4.4.蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。每條具有完整三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈，稱為每條具有完整三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈，

14、稱為亞亞基基 (subunit)。血紅蛋白（血紅蛋白（Hb）的四級結(jié)構(gòu)）的四級結(jié)構(gòu)（1.1.）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)二二硫硫鍵鍵 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性尿素、尿素、-巰基乙醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性（2 2）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系例：鐮刀形紅細胞貧血例：鐮刀形紅細胞貧血N-Val His Leu Thr Pro Glu Glu C(146) HbS 肽鏈肽鏈HbA 肽肽 鏈鏈N-

15、Val His Leu Thr Pro Val Glu C(146) 這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為稱為“分子病分子病”。肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu) （3.3.）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （4.）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾?。┑鞍踪|(zhì)構(gòu)象改變與疾病 蛋白質(zhì)構(gòu)象病蛋白質(zhì)構(gòu)象病：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導(dǎo)致發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象病的機理：

16、蛋白質(zhì)構(gòu)象病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，稱為螺

17、旋，稱為PrPc。PrPc在在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為-折疊的折疊的PrPsc，從而致病。，從而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折疊折疊正常正常瘋牛病瘋牛病 1. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（Watson Crick,1953）四、遺傳信息的傳遞四、遺傳信息的傳遞The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962 Central Dogma2.中心法則提出中心法則提出（Crick，1958）Crick,1916-2004反轉(zhuǎn)錄機制闡明反轉(zhuǎn)錄機制闡明（ Temin 1970 ）補充的中心法則補充的中

18、心法則五、基因的概念五、基因的概念 三大成就三大成就 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；質(zhì)基礎(chǔ)問題； 50年代提示了年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制機制保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；替問題； 50年代末至年代末至60年代，相繼提出了年代，相繼提出了“中心法則中心法則”和操縱子學(xué)說和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達

19、。識了遺傳信息的流動和表達。 現(xiàn)在人們認為，基因是實體，它的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA或或RNA，基因是具有一定遺傳效應(yīng)的DNA分子中特定的核苷酸序列，它是遺傳信息傳遞和性狀分化、發(fā)育的依據(jù)遺傳信息傳遞和性狀分化、發(fā)育的依據(jù)，基因是可分的。根據(jù)基因的產(chǎn)物可將其分為結(jié)構(gòu)基因、調(diào)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、無翻譯產(chǎn)物基因節(jié)基因、無翻譯產(chǎn)物基因。簡而言之，基因是一個含有特含有特定遺傳信息的核苷酸序列，它是遺傳物質(zhì)的最小功能單位定遺傳信息的核苷酸序列，它是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。第二節(jié) 植物基因工程常用的工具酶 限制性內(nèi)切核酸酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 其他工具酶常用工具酶及其功能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶切

20、割DNADNA連接酶連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶聚合酶探針標(biāo)記、補平3末端反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶3切除末端磷酸基DNA外切酶外切酶3末端切除單核苷酸噬菌體噬菌體DNA外切酶外切酶5末端切除單核苷酸一、限制性內(nèi)切核酸酶一、限制性內(nèi)切核酸酶 限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。 型限制性內(nèi)切酶

21、型限制性內(nèi)切酶 型限制性內(nèi)切酶定義：凡在識別并切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。名稱名稱屬名（大寫）屬名（大寫） 種名（小寫）種名（小寫） 株名株名分離序號分離序號來源菌體來源菌體EcoR REcoREscherichiacollR株株Hind dHindHaemophilusInfluenzaed株株Hind dHindHaemophllusInfluenzaed株株HpaHpa/HaemophllusParainfluenzae限制性內(nèi)切酶的命名舉例型限制酶的作用性質(zhì) 1、基本特性：（1）識別位點為48個核苷酸序列；（2）識別位點即為切割位點；（3）位點上核苷酸順序通常

22、呈雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的識別序列的識別序列EcoR I的切割位點的切割位點切割方式通常有三種：在識別順序兩條鏈對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成齊平末端。如Hae， PvuII。在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側(cè)同時從5端切斷磷酸二酯鍵，形成5磷酰基端2-5個核苷酸單鏈粘性末端。如EcoR。在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側(cè)同時從3端切斷磷酸二酯鍵，形成3羥基端25個核苷酸單鏈粘性末端。如Pst。PvuII等產(chǎn)生的平頭末端等產(chǎn)生的平頭末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-

23、G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 EcoRI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的5粘性末端粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P Ho-G-C-T-C 5 退火退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G

24、-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHPPstI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的3粘性末端粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火退火 4-7 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP二、二、DNADNA連接酶連接酶（一）（一） DNA連接酶和連接酶和T4DNA連接

25、酶連接酶DNA連接酶連接酶1976年發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于細胞內(nèi)。目前應(yīng)用的多數(shù)來自于大腸桿菌，稱為E.coliDNA連接酶。分子量74000dal,輔因子NAD+,其作用是封閉雙螺旋骨架上具有5-磷酰基和3-羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick（T4DNA連接酶）連接酶）T4DNA連接酶連接酶T4DNA連接酶來自于連接酶來自于T4噬菌體感染的噬菌

26、體感染的E.coli，為，為T4噬菌體自噬菌體自身的表達產(chǎn)物。分子量身的表達產(chǎn)物。分子量6.8萬萬dal，輔因子位，輔因子位ATP，該酶既能，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。連接粘性末端，亦能連接齊平末端。修復(fù)與修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5連接多個平頭雙鏈連接多個平頭雙鏈DNA分子：分子：5

27、G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶連接酶（二）連接酶的作用（二）連接酶的作用 用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。 具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當(dāng)載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的構(gòu)建出新的DNA雜種分子雜種分子。 DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體。a. DNA的粘性

28、末端；b. DNA的平末端； c. 化學(xué)合成的具有粘性末端的DNA片段。三、三、DNADNA聚合酶聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段 T4 DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶 T7噬菌體DNA聚合酶（一）大腸桿菌DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶在分子克隆中的主要作用是采用缺口平移法標(biāo)記DNA，制備放射性DNA探針，用于核酸雜交分析。DNA聚合酶的酶活性： 1. 5 -3的聚合酶活性； 2. 5 - 3的外切酶活性； 3. 3 - 5的外切酶活性（較低）。（二）大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段 大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段是大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)舒替蘭酶處

29、理，去除全酶中的5 3外切核酸酶活性，保留了5 3聚合酶活性和3 5外切核酸酶活性。（三）T4DNA聚合酶T4 DNA Polymerase，即T4 DNA聚合酶，是一種模板依賴的DNA聚合酶，可以在結(jié)合有引物的單鏈DNA 模板上，從53方向催化方向催化DNA合成合成反應(yīng)。T4 DNA Polymerase具有35外切酶活性，但不具有外切酶活性，但不具有53外切酶活性外切酶活性。 特點：可以用于將特點：可以用于將5端突出末端補平或端突出末端補平或3端突出末端削平。端突出末端削平。T4 DNA Polymerase的35DNA外切酶活性對于單鏈DNA要比雙鏈DNA活性更高，即單鏈DNA要比雙鏈D

30、NA中的非配對鏈部分更容易被T4 DNA Polymerase所消化。T4 DNA Polymerase的35外切酶活性比Klenow Fragment要高約200倍。（四）反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） 這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。 （五）T7噬菌體DNA聚合酶 T7噬菌體DNA聚合酶來源于T7噬菌體感染的E.coli，為兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體，一種是噬菌體基因5蛋白，另一個是宿主蛋白的硫氧還蛋白。T7噬菌體DNA聚合酶是所有所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力聚合酶中

31、持續(xù)合成能力最強的一個，產(chǎn)物平均長度要大得多最強的一個，產(chǎn)物平均長度要大得多，在測定核苷酸序列時有優(yōu)勢。它的活性功能與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類似，但3-5外切活性為Klenow的1000倍。T7噬菌體DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于長模板的引物延伸。Sequenase（測序酶）是美國United States Biochemical公司改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3-5外切活性。Sequenase Version 2切除了所有的3-5外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對長片段進行測序的理想用酶。四、其他工具酶四、其他工具酶 末端轉(zhuǎn)移酶 堿性磷酸酶 D

32、NA甲基化酶 S1核酸酶（一）末端轉(zhuǎn)移酶 分子克隆中常用的末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細胞及分化早期的類淋巴樣細胞內(nèi)的一種不尋常的DNA聚合酶，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。在二價陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3-OH 。若dNTP為T或C，此二價陽離子首選CO2+；若dNTP為A或G此二價陽離子首選Mg2+。在基因工程中，利用末端轉(zhuǎn)移酶不需要模板，在基因工程中，利用末端轉(zhuǎn)移酶不需要模板， dNTP中任何一個都可中任何一個都可以作為反應(yīng)前體物的特征，給平末端以作為反應(yīng)前體物的特征，給平末端DNA片段片段3-OH加上同聚物加上同聚物poly(C) 或或pol

33、y(G)，也可以加上，也可以加上poly(T)或或poly(A)，形成同聚物加尾，形成同聚物加尾構(gòu)建重組技術(shù)。構(gòu)建重組技術(shù)。（二）堿性磷酸酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶： 來自于大腸桿菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛腸（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成為5-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5端同位素標(biāo)記或為了避免DNA片段自身連接（或環(huán)化）時可進行脫磷酸反應(yīng)。 堿性磷酸酶的活性堿性磷酸酶的應(yīng)用（三）DNA甲基化酶 原核生物甲基化酶是作為限制

34、與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主 DNA 不被相應(yīng)的限制酶所切割。在 E.coli 中，大多數(shù)都有三個位點特異性的 DNA 甲基化酶。 甲基化酶使DNA分子的腺嘌呤或胞嘧啶堿基甲基化，免受內(nèi)源性限制酶切割，從而將能被限制性內(nèi)切酶識別的未被甲基化的DNA分子和不可識別的甲基化方式的DNA分子區(qū)別開來，起到保護DNA分子的作用。（四）S1核酸酶來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。核酸酶S的應(yīng)用第三節(jié) 園藝植物基因工程常用的載體 能將目的基因攜帶至宿主細胞并可在其中自主復(fù)制的遺傳因子謂之為基因工程載體。相關(guān)概念相關(guān)概念 有用基因亦稱為目的基因或

35、插入物 用于接受重組DNA的擴增載體及其插入物或表達目的基因的受體細胞謂之宿主 插入物的擴增過程稱為分子克隆 攜帶重組DNA分子的宿主為基因工程細胞（菌）或重組細胞（菌）基因工程載體的必備條件基因工程載體的必備條件1、能自主復(fù)制2、具有可供選擇的遺傳標(biāo)記3、具克隆位點4、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小, 載力要大5、載體特征明確：基因，酶切位點，核苷酸序列質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 噬菌體載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體人工染色體載體一、質(zhì)粒一、質(zhì)粒質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子分子質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)分子量小，差異顯著，1

36、-500kb。易于在宿主間轉(zhuǎn)移和遷移。在宿主內(nèi)可伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制，與宿主呈共生關(guān)系。 且其存在與否與宿主生死無關(guān)。 編碼宿主染色體不具有的基因，賦予宿主細胞額外遺傳特性 （如抗生素抗性）pBR322 是一種人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒 特點：帶有多種抗藥性的強選擇標(biāo)記 具有低分子量，高拷貝 外源DNA插入不影響復(fù)制功能 有多種核酸內(nèi)切限制酶單切割位點命名: p：表示質(zhì)粒 BR:分別取自兩位主要構(gòu)建者F.Bolioax 和R.L.Rodrignez姓氏的頭一個字母 322:指實驗室編號pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI ISca

37、ScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)1、來源于來源于pSF2124質(zhì)粒質(zhì)粒易位子易位子Tn3的的ampr2、來源于、來源于pSC101質(zhì)粒的質(zhì)粒的tetr3、來源于、來源于ColE1的派生質(zhì)的派生質(zhì)粒粒pMB1的的DNA復(fù)制起復(fù)制起點點pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點自身分子量小 4363bp同時具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號具有較高的拷貝數(shù)pUC質(zhì)粒載體是在pBR322載體質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，組入了一個在其5端帶有一段多克隆位點的lacZ基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯

38、色原理的顯色原理 pUC18/19 Plac lacZMCS -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽段肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN 5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚基吲哚基- -D-半乳糖苷半乳糖苷X-gal5-溴溴-4-氯靛藍（藍色）氯靛藍（藍色）(2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷貝數(shù)(500700)適用于組織化學(xué)方法檢測重組體具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以更方便的插入外源基因二、噬菌體載體二、噬菌體載體(一一)噬菌體噬菌體DNA1、噬菌體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)噬菌體為雙鏈DNA病毒，宿主為E.Coli。在宿主內(nèi)有溶菌和溶源兩種形式，

39、在溶源方式中，噬菌體感染宿主后其DNA整合到宿主染色體DNA中，伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。噬菌體DNA是有48502bp組成的線性雙螺旋分子，分子量3.1107dal。迄今已定位的基因至少61個，其中一半?yún)⑴c了噬菌體生命周期的活動，我們稱這類基因為噬菌體的“必要基因 ”；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因為噬菌體的“非必要基因”。這為其作為基因工程噬菌體的基礎(chǔ)。2、 噬菌體DNA克隆載體野生型的DNA不適宜作為克隆載體。因為其分子量較大，常用的限制酶切點較多。如EcoRI切點5個，Hind切點7個，而這些切點大多位于溶菌周期生長所必須基因內(nèi)，容納不下

40、比其更大的外源性DNA片段，必須對其進行改造。改造后，可構(gòu)建兩類噬菌體派生載體取代型載體或替換型載體（replacement vector） 它具有成對的克隆位點，這兩個位點之間的DNA 區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。如EMBL4 和Charon40。插入型載體（insertion vectors）只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點（也有一些具有兩個插入位點）。外源性DNA克隆到插入型的載體分子上會使噬菌體的某中生物功能喪失，即所謂插入失活效應(yīng)。如免疫功能失活的和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。特點：特點：以噬菌體DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感

41、染宿主的能力。經(jīng)包裝后重組DNA分子轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。這類載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。1、概述噬菌體一般有效克隆外源基因范圍僅為15kb左右，但有些基因可達35-40kb，甚至更大，同時噬菌體不能夠同時克隆兩個連鎖基因。為此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人發(fā)展出科斯質(zhì)粒載體，可滿足以上需要?！癱osmid”一詞是由英文“cos site-carrying plasmid”縮寫而成，其愿意是指帶有粘性末端位點(cos)的質(zhì)粒。三、柯斯載體三、柯斯載體(cosmid)(cosmid) 定義：科斯質(zhì)粒是人工構(gòu)建的，含有DNA 的粘性(cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)

42、制起始區(qū)及質(zhì)粒一個抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的特殊載體。2、Cosmid的特點目前已有許多不同類型的科斯質(zhì)粒載體，其特點如下： 具有噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體特性；具有高容量的克隆能力；具有與同源序列的質(zhì)粒進行重組的能力。四、人工染色體載體四、人工染色體載體 YAC 載體主要是用來構(gòu)建大片段 DNA 文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。 真核生物染色體的幾個關(guān)鍵部分： 著絲粒 端粒 自主復(fù)制序列第四節(jié) 植物基因工程的基本技術(shù) 核酸分離技術(shù) 核酸電泳技術(shù) 核酸體外擴增技術(shù) 分子雜交技術(shù)一、核酸分離技術(shù)一、核酸分離技術(shù)（一）（一） DNA的提取

43、的提取CTAB法法SDS法法DNA提取的基本步驟提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.核酸溶解在適量緩沖液或水中1. RNA的不穩(wěn)定性的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的由于核糖殘基的2和和3位置帶有羥基，位置帶有羥基，RNA易于易于被被RNA酶切割水解酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活性，不易失活（二）（二） RNA的提取的提取 2-deoxyribose sugars Phosphodiester linkages Directional chain (5

44、 to 3) 4 Bases purines: adenine & guanine pyrimidines: cytosine & thymineDNA is a polymer of2-deoxyribonucleotidesGCTAp5 end3 endCGTAHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOO P O CH2OOCNNCHCCHNH2NH2CCNNNCHCNHCOOO P O CH2OO-PO32OOO P O CH2ONCCOHNCHCOCH3123453RNA is a polymer of ribonucleotides ribose sugars

45、 Phosphodiester linkages Directional chain (5 to 3) 4 Bases purines: adenine & guanine pyrimidines: cytosine & uracilGCUApCGUA5 end3 end123453OHHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOO P O CH2OOCNNCHCCHNH2OHOOO P O CH2ONCHCOHNCHCOOHNH2CCNNNCHCNHCOOO P O CH2OO-PO32OHRNA is easily hydrolyzed under alkaline

46、conditionsThe reaction proceeds through a 2,3-cyclic monophosphate intermediate. Enzymatic hydrolysis of RNA by RNase proceeds through a similar intermediate. Because DNA lacks the 2-OH group, it is stable under alkaline conditions. .O P O-CH2OOONOHOO P O CH2OONOHOO P OO.OHONOHOO P OO.HOCH2O.O P O-C

47、H2OONOOPOOH+.O P O-CH2OOONOHOO P OHOmixture of 2- and 3- monophosphate derivativesH2Oshortened RNARNA提取提取RNA的注意事項的注意事項(1)(1)玻璃制品、塑料制品和電泳槽玻璃制品、塑料制品和電泳槽: :玻璃器皿玻璃器皿可在可在150烘烤烘烤4小時，塑料器皿可在小時，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除可去除RNase。(2)(2)研究人員造成的污染研究人員造成的污染: :經(jīng)常更換新手套經(jīng)常更換新手套(3)(3

48、)污染的溶液污染的溶液: :避免交叉污染。避免交叉污染。常用常用RNA酶抑制劑酶抑制劑 焦磷酸二乙酯焦磷酸二乙酯（DEPC）：）： 與與RNA酶的活性基團組氨酸酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強烈但不徹底的的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強烈但不徹底的RNA酶抑酶抑制劑制劑 。 異硫氰酸胍異硫氰酸胍：目前是最有效的：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織酶抑制劑，裂解組織的同時也使的同時也使RNA酶失活。既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核酶失活。既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。酶有強烈的變性作用。 氧釩核糖核苷復(fù)合物氧釩核糖核苷復(fù)合物：

49、由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制制RNA酶的活性。酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制劑酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是是RNA酶的一種非酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。酶結(jié)合，使其失活。 其它：其它：SDS、尿素、硅藻土等對、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作酶也有一定抑制作用。用。RNA提取的步驟提取的步驟材料的裂解材料的裂解

50、雜質(zhì)的去除雜質(zhì)的去除RNA的吸附或沉淀的吸附或沉淀異硫氰酸胍異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸月桂肌氨酸 等。使細胞及核蛋白復(fù)等。使細胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸，有效抑制核酸酶。酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使使DNA及蛋白沉淀到有機相。及蛋白沉淀到有機相。硅質(zhì)材料的吸附硅質(zhì)材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經(jīng)經(jīng)DEPC 處理的水溶解處理的水溶解RNA材料準備及裂解材料準備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)

51、少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提?，F(xiàn)提。組培細胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取組培細胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位雜質(zhì)少的部位, 細菌和酵母需要勻漿處理。細菌和酵母需要勻漿處理。對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲存液中保存。樣品儲存液中保存。液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充；加入裂解液并且徹底而迅液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。速地勻漿。雜質(zhì)的抽提雜質(zhì)的抽提采用有機（酚采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分

52、混勻氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間，使蛋白質(zhì)、多糖和離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間，使蛋白質(zhì)、多糖和DNA分布到中間層和有機相中，分布到中間層和有機相中，RNA留在水相中留在水相中對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機溶劑抽提對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機溶劑抽提RNA的沉淀和溶解的沉淀和溶解 含含RNARNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質(zhì)蛋白多糖等雜質(zhì) 或使用異丙醇沉淀或使用異丙醇沉淀RNARNA應(yīng)充分的混勻并放置應(yīng)充分的混勻并放置10min10min

53、左左右離心收集沉淀，右離心收集沉淀，7070乙醇洗滌，晾干乙醇洗滌，晾干 用經(jīng)用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解RNA 樣品收集后或需長期保存時應(yīng)置于樣品收集后或需長期保存時應(yīng)置于70 或加入或加入RNase抑制劑，分裝使用抑制劑，分裝使用二、核酸電泳技術(shù)二、核酸電泳技術(shù) 自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段?；蚪M基因組DNA的檢測的檢測提取的基因組提取的基因組DNA片片 段在段在20kb30kb之間之間高質(zhì)量的基因組高質(zhì)量的

54、基因組DNA 帶型帶型 單一無拖尾現(xiàn)象單一無拖尾現(xiàn)象DNA濃度及純度的檢測濃度及純度的檢測（A260=1 約約 50 g/ mL 雙鏈雙鏈DNA； A260/280 約為約為1.8 ） RNA的檢測的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理電泳槽系統(tǒng)的處理含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測純度及濃度的檢測 （A260=1 ，約，約40 g/ mL RNA； A260/A280 約為約為1.9-2.1 ） 瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間。 聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。 凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力

55、就越強。 在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。 溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。 普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。三、核酸體外擴增技術(shù)三、核酸體外擴增技術(shù)PCRPCR技術(shù)技術(shù) PCR基本概念 PCR基本原理及示意圖 PCR反應(yīng)的組成物質(zhì) PCR

56、反應(yīng)體系及擴增程序 由基本PCR拓展的相關(guān)技術(shù)PCR技術(shù)技術(shù) （Polymerase chain reactionPolymerase chain reaction） PCR (Polymerase chain reaction)即：聚合酶鏈式反應(yīng)，是指在體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù)，也稱無細胞分子克隆系統(tǒng)。是1985年由美國的Kary B. Mullis等人首創(chuàng)并由美國Getus公司開發(fā)的一項專利，應(yīng)用該方法可使極微量的特定DNA片斷在幾小時內(nèi)迅速擴增到百萬倍。具有特異性強，靈敏度高和快速準確的優(yōu)點，因而發(fā)展迅速，應(yīng)用范圍越來越廣泛，不僅可用于基因表達調(diào)控，基因克隆與測序，特異基

57、因篩選等基礎(chǔ)研究，而且在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993 Kary B. Mullis （1944 ） La Jolla, CA, USA2.PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理 根據(jù)已知的待擴增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補的兩段寡核苷酸引物，在體外將DNA模板在酶促作用下進行擴增。PCR全過程可分為DNA模板變性、退火、延伸三個步驟，經(jīng)若干循環(huán)所組成。首先高溫作用使模板DNA變性解鏈，然后降低溫度使引物與模板DNA鏈退火，在TaqDNA 聚合酶作用及dNTP底物存在下，引物鏈

58、將沿著5 3方向延伸與模板互補的新鏈，新鏈則可作為下一次反應(yīng)的模板，因此擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加。通常單一拷貝的基因經(jīng)2530循環(huán)可擴增100萬200萬拷貝。未擴增的未擴增的DNAA上游引物上游引物B下下游引物游引物5 端是人工合成的引物，端是人工合成的引物，是特定的，是特定的，3 端沒有固端沒有固定的終止點定的終止點特定的擴增產(chǎn)物在第特定的擴增產(chǎn)物在第2個循環(huán)中出現(xiàn)，以后個循環(huán)中出現(xiàn)，以后快速擴增，成為主要快速擴增，成為主要擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物BABBABAABABABABA循環(huán)循環(huán)1變性變性退火退火延伸延伸循環(huán)循環(huán)2變性、退火變性、退火延伸延伸靶序列靶序列未擴增的未擴增的DNA循環(huán)循環(huán)3n

59、個循環(huán)后，個循環(huán)后，5 端是端是特定的人工合成的引特定的人工合成的引物，物，3 端沒有固定的端沒有固定的終止點的終止點的DNA鏈擴鏈擴增量為增量為2n。變性、退火變性、退火延伸延伸ABBBAABAABBABABABABBA3. PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)反應(yīng)的組成物質(zhì) 完成PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)主要有引物、dNTPs、DNA聚合酶(Taq酶)、緩沖液、Mg2+及DNA模板等，其基本特征和要求介紹如下。3.1 引物引物 引物是與待擴增DNA片斷兩側(cè)互補的寡核苷酸，是決定PCR擴增特異性的關(guān)鍵因素，引物設(shè)計與合成的好壞直接決定PCR擴增的成效。 引物設(shè)計主要考慮：引物長度一般為1530堿基，太短容易產(chǎn)生許

60、多不同的DNA擴增片段，產(chǎn)生與非靶序列的雜交；太長影響PCR效率。 堿基組成 引物3不應(yīng)超過3個連續(xù)的G（或C），引物自身及引物間不應(yīng)存在互補序列，否則易形成引物二聚體。 引物3不能進行修飾，由于引物與模板結(jié)合后，是從3開始延伸引物的，第一位的錯配將影響擴增效率。3.2 dNTP dNTPs是PCR反應(yīng)所必須的底物，為四種核苷酸的混合物(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。最適宜的dNTPs終濃度應(yīng)根據(jù)被擴增片斷的長度和堿基組成來確定。3.3 DNA聚合聚合酶酶 目前PCR擴增中最常用的DNA聚合酶是TaqDNA，它是由水生棲熱菌產(chǎn)生，熱穩(wěn)定性好。它的用量多少對PCR擴增效率及特異性有一定影響。另外近年來還使用耐熱