細(xì)胞損傷模型

1、一、體外肝細(xì)胞損傷模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)大鼠4戊巴比妥麻醉，門靜脈插管，先以無鈣灌流液灌流，繼以37通入O2的型膠原酶灌流液繼續(xù)循環(huán)灌流15 min。將肝臟移至一平皿內(nèi)，輕輕撕去肝包膜后，加入含5小牛血清的清洗液，用吸管吹打成單個肝細(xì)胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾，低速離心（500 r·min-1，1 min，4）棄上清，同法用清洗液反復(fù)洗3次。然后用完全1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素和10 mg·L-1胰島素）制成1×109個·L-1肝細(xì)胞懸液。分離的

2、肝細(xì)胞經(jīng)0.6臺盼藍(lán)拒染法測得細(xì)胞活力大于90，高碘酸雪夫反應(yīng)顯示糖原法鑒定99為肝實質(zhì)細(xì)胞。將上述肝細(xì)胞懸液分別加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培養(yǎng)板中，置37，5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1216 h后可見肝細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)板孔底上生長。2CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死性損傷模型的建立肝細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，吸棄上清，更換培養(yǎng)液并加入不同濃度的CCl4（116mmol·L-1），以少量的二甲亞砜助溶，二甲亞砜終濃度為0.1（體積分?jǐn)?shù)），作用不同時間（112 h）后，收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測AST，以及肝細(xì)胞的MDA含量和GSHpx活性；同步測定96孔板中培養(yǎng)肝細(xì)胞的MTT反

3、應(yīng)。根據(jù)檢測結(jié)果制備CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的量效和時效曲線。選擇最造損傷濃度和損傷時間制備肝細(xì)胞的損傷模型，同時設(shè)溶媒對照組，每組至少設(shè)3個復(fù)孔。3H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死性損傷模型的建立同法更換培養(yǎng)液，加入不同濃度的H2O2（0.23.2 mmol·L-1），作用不同時間（0.54 h）后，收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測ALT，測定肝細(xì)胞的MDA含量；同步測定96孔板中培養(yǎng)肝細(xì)胞的MTT反應(yīng)。根據(jù)檢測結(jié)果制備H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的量效和時效曲線，選擇最適損傷濃度和損傷時間制備肝細(xì)胞的損傷模型，同時設(shè)溶媒對照組，每組至少設(shè)3個復(fù)孔。4檢測指標(biāo)（1）  AST、ALT的測定培養(yǎng)的

4、肝細(xì)胞經(jīng)離心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按試劑盒說明書步驟測定上清液中AST和(或)ALT活性，結(jié)果以U·(106 cell)-1表示。（2）  肝細(xì)胞增殖試驗采用MTT比色法。（3）  肝細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶（GSHpx）活性的測定先制備GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線。棄肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入0.2 Triton-100水溶液0.5 ml，混勻，2 min后，離心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝細(xì)胞樣品）0.4 ml，另設(shè)樣品空白管，非酶反應(yīng)管和試劑空白管，加入各種試劑。混勻后立即計時，靜置12 min后

5、，以樣品空白管調(diào)零點(diǎn)，于423 nm波長處讀得吸光度（A）值。在GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的GSH波度。GSHpx酶活力單位是在37，pH6.5條件下，每106個肝細(xì)胞、每分鐘使GSH濃度下降1 mol為1個酶活力單位。計算公式為：GSHpx活力單位=（GSH非酶管-GSH樣品管-GSH試劑空白管）/3。結(jié)果以U·(106 cell)-1表示。（4 ） 肝細(xì)胞丙二醛（MDA）含量的測定先制備MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線。棄肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入生理鹽水1 ml，混勻，移入離心管中，離心（2 500 r·min-1，10 min），棄上清，加15 TCA 2 ml，破壞細(xì)胞并沉淀蛋白質(zhì)，加入0

6、.67 TBA 2 ml，于沸水浴中加熱30 min。根據(jù)樣本的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的濃度，結(jié)果以 nmol·(106 cell)-1表示。（5）  數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以±s表示，計量資料組間比較采用t檢驗。兩變量間相互關(guān)系，采用直線相關(guān)和回歸分析。二、體內(nèi)肝損傷模型（酒精）1、材料純系SD雄性大鼠，體重180g200 g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。食用酒精選用北京釀酒總廠出品的56度紅星二鍋頭。2、方法將大鼠隨機(jī)分成5組，飼養(yǎng)在2325室內(nèi)，自由進(jìn)食、進(jìn)水；根據(jù)大鼠體重，A、B、C、D組每日用56°紅星二鍋頭白酒以10ml/1Kg分別灌胃 0

7、、4周、8周和12周；E組于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠通過股動脈采血處死，收集血漿和肝臟標(biāo)本。3、主要指標(biāo)檢測（1）肝功能：應(yīng)用日立7170自動生化分析儀測定總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glb）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等。（2）氧化抗氧化物質(zhì)測定：采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒分別檢測丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）。（3）大鼠肝臟病理檢查：大鼠處死后立即取出肝臟，稱重后一部分以10%的福爾馬林液固定作病理，作常規(guī)石蠟切塊并HE染色，

8、在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，用半定量法分別判定脂肪變性、及酒精性肝炎炎癥活動度三、四氯化碳體外損傷肝細(xì)胞模型原代培養(yǎng)的正常大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)24h（貼壁良好）后，置培養(yǎng)皿于一密閉的塑料盒，內(nèi)置四氯化碳0.4M容積，37度90min，造成肝細(xì)胞損傷的模型，后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)，進(jìn)行下一步實驗。(即熏蒸法)肝細(xì)胞培養(yǎng)12h后，吸棄上清，更換培養(yǎng)液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO終濃度1），作用6h后收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測AST以及肝細(xì)胞MDA含量盒GSHpx活性，評價損傷程度。（常用方法）四、醋氨酚體外損傷肝細(xì)胞模型肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后，用清洗液洗2次，培養(yǎng)液洗1次，然后換以20mM醋氨酚

9、的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12h，取培養(yǎng)液，進(jìn)行下一步實驗。五、過氧化氫體外損傷肝細(xì)胞模型肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸棄上清液，更換培養(yǎng)液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培養(yǎng)上清液檢測AST活性和MDA含量。六、氰化鉀缺氧肝細(xì)胞損傷模型肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后，貼壁生長良好的肝細(xì)胞中加入氰化鉀2.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)2h，定量檢測培養(yǎng)液上清中LDH活性，以及酶的活性反應(yīng)肝細(xì)胞損傷程度。本模型可以更好的模擬缺氧損傷。七、硫代乙酰胺（TTA）體外肝細(xì)胞損傷模型肝細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24h后，貼壁生長良好的肝細(xì)胞中加入TTA0.18mM，繼續(xù)培養(yǎng)48h，肝細(xì)胞大量損傷和壞死，上清液中乳酸脫氫酶（LDH）活性升

10、高，造成體外損傷肝細(xì)胞模型。八、內(nèi)毒素體外損傷肝細(xì)胞模型貼壁生長良好的肝細(xì)胞中加入內(nèi)毒素70uL/mL，置37度，5CO2培養(yǎng)此時上清LDH活性升高造成肝細(xì)胞損傷模型，造成體外肝細(xì)胞損傷模型。九、半乳糖胺（GalN）體外損傷模型分離肝細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)12-24h后，待細(xì)胞貼壁生長均勻后，加入5mMGalN的肝細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，測定培養(yǎng)上清液中ALT，ALT顯著升高時，肝細(xì)胞造模成功。十、帕金森體外模型體外培養(yǎng)的中腦多巴胺能神經(jīng)元MPTP損傷模型l實驗操作：實驗采用胚胎齡14一16天的大鼠，剖子宮取胎，取胎鼠中腦腹側(cè)區(qū)?？蓪⒍鄠€胚胎來源的組織收集在一起，置Fl2培養(yǎng)基（Gibco）至35

11、mm的培養(yǎng)皿中，以細(xì)剪刀剪碎。將2ml含0.125的胰酶的F12加入到組織中，該混合物于37孵育10分鐘后，加入DNase I（Sigma）至終濃度80ngm1，繼續(xù)于37oC孵育10分鐘。消化后的組織以尖端被火拋光的移液管輕輕吹打8次。該細(xì)胞懸液以種植培養(yǎng)基稀釋（種植培養(yǎng)基： MEM，補(bǔ)充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mgml谷胱甘肽，10 unitsml青霉素，10ul/ml鏈霉素和7.5胎牛血清）。細(xì)胞然后種植于35mm的預(yù)先以10ugm1 po1y1ysine （Sigma）和2.5ugml merosin（Chemicon）鋪底的培養(yǎng)皿中，種植密度為50,000細(xì)胞cm2。

12、培養(yǎng)16小時后，培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基為F12和basa1Eag1es medium，補(bǔ)充以33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺， 15 mM碳酸氫鈉，10mM HEPES（pH7.0），1ugml谷胱甘肽，20ug/ml胰島素， 100ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白， 60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亞硒酸鈉（NaSe），30nM三碘甲狀腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml鏈霉素。毒物處理：于第4天以1uMMP+處理48小時。然后進(jìn)行分析。模型評價：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞計數(shù)、免疫組化檢測TH陽性細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)。體外培養(yǎng)的中腦多巴胺能神經(jīng)元6-OHDA損傷模型采用上

13、述方法選擇胎鼠，分離中腦腹側(cè)部，解剖顯微鏡下仔細(xì)剔除腦膜和血管，用高糖T-BSS反復(fù)沖洗滌之七遍。并將組織剪碎，移入0.25胰蛋白酶溶液中，37oC振蕩消化30分鐘，后加入血清數(shù)滴終止消化，用吸管輕輕吹打后，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液混勻，1000rpm，10min離心收集細(xì)胞，反復(fù)2次，后加入含血清的完全DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，過220目不銹鋼篩網(wǎng)使成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后將約3×106個細(xì)胞接種人事先涂有多聚賴氨酸的35mm的六孔培養(yǎng)板中，置37oC、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后待細(xì)胞完全貼壁時，置換舊培養(yǎng)液，以后每隔2天更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第六天時加入100uM的6-OHD

14、A處理3小時后吸出。在相應(yīng)備孔中加入完全DMEM培養(yǎng)液洗滌2遍，再加入完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)置5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，采用與上述相同的方法做免疫細(xì)胞化學(xué)染色，計數(shù)TH陽性細(xì)胞，確立6-OHDA對體外培養(yǎng)的多已胺能神經(jīng)元的損傷作用。十一、損傷模型取出生1-2d的乳鼠，用麻醉劑處死。在D-hanks液中取大腦并分離海馬組織，胰蛋白酶消化，獲得細(xì)胞懸液，胎盤藍(lán)染色進(jìn)行死活細(xì)胞記數(shù)，將細(xì)胞以5×105/ml的密度接種于預(yù)先經(jīng)L-多聚賴氨酸處理的96孔和24孔培養(yǎng)板,其中24孔板中預(yù)先放置有蓋玻片。細(xì)胞維持在培養(yǎng)液中，置入5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后全換液，接種當(dāng)天為第一

15、天,每3d半量更換培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)第3天時加入阿糖胞苷,終濃度為10mol/,以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖,24后更換全部培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),第10天進(jìn)行細(xì)胞造模，開始實驗。也可以用PC12細(xì)胞株,常規(guī)培養(yǎng)產(chǎn)物誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞，建立細(xì)胞模型：選擇25-35片段,用三蒸水配制成100mol?-1,過濾,分裝,-20凍存;使用前老化處理并配制成所需濃度。（將25-35溶解在DMSO中，在用DMEM稀釋，置于37下孵育7-14天，即為老化狀態(tài)）。細(xì)胞模型建立:加入濃度為20?mol/L的25-35,接觸24h,誘導(dǎo)建立AD細(xì)胞模型.檢測指標(biāo):MTT LDH 凋亡 細(xì)胞內(nèi)鈣離子 以及SOD等十二、抑郁癥的

16、體外模型抑郁等精神疾患的發(fā)生可能與過量GC對海馬的選擇性損傷有關(guān),但機(jī)理不明,Heuser和Cosi等報道可能是由于高濃度GC導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)水平降低造成的,而抗抑郁劑不僅使GC受體上調(diào),HPA軸反饋恢復(fù)正常,而且使神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)升高,達(dá)到治療目的.PC12細(xì)胞株為大鼠嗜鉻細(xì)胞克隆化細(xì)胞株,分化的PC12細(xì)胞有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征,其胞膜上GC受體表達(dá)豐富6.本文根據(jù)文獻(xiàn)方法以高濃度皮質(zhì)酮(corticosterone)模擬抑郁及焦慮癥神經(jīng)細(xì)胞損傷狀態(tài)實驗操作(MTT法測定細(xì)胞存活力)嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12細(xì)胞.用含5%胎牛血清及5%馬血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素鈉200kU.L-1,鏈霉

17、素100mg.L-1pH7.4)調(diào)細(xì)胞密度為2x108L-1接種于預(yù)先用多聚賴氨酸(0.1g.L-1)處理過的96孔培養(yǎng)板,每孔10LL,放入CO2孵箱,培養(yǎng)34d,待細(xì)胞長滿孔底后即可用于實驗.參照文獻(xiàn)方法,稍加修改,吸去細(xì)胞液換上含有相應(yīng)濃度藥物及0.2mmol.L-1皮質(zhì)酮的無血清DMEM(對照組不含任何藥品),培養(yǎng)48h,吸去培養(yǎng)液,用D2Hanks液洗2遍,每孔加入含0.5g#L-1MTT的無血清DMEM培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)液,每孔加入10%十二烷基硫酸鈉100LL,待藍(lán)色顆粒完全溶解(約1216h),用多孔掃描分光光度計測定標(biāo)本在570nm波長處的吸光度(A570nm)值,用于定量反

18、映活細(xì)胞數(shù).十三、125I-UdR致C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞損傷的模型1、材料：125I-UdR購自中科院北京原子能所，放化純度>95%。脫氧腺苷（AdR）、脫氧鳥苷（GdR）、脫氧胞苷（CdR）、脫氧尿苷（UdR）均為Sigma公司產(chǎn)品。2、方法（1）細(xì)胞培養(yǎng)：當(dāng)癌細(xì)胞貼壁生長超過瓶壁的70%，用胰蛋白酶消化30-40s，傳代培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞每3-4d傳代1次。在50ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106個細(xì)胞后，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活實驗。（2）細(xì)胞存活實驗：將制備好的細(xì)胞按1×105個/ml細(xì)胞接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)20小時，實驗組加入125I-UdR74KB

19、q/ml及不同濃度的AUCG（10M、20M、30M、50M、80M）再共同孵育24h后，100倍的倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，2-3d后換液，8-9d后細(xì)胞集落形成，每個劑量點(diǎn)設(shè)復(fù)瓶4瓶，同時設(shè)對照組未加AUCG，另設(shè)空白組，均為4個復(fù)瓶。計算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，繪制細(xì)胞存活曲線。3、檢測方法（1）采用TEM技術(shù)觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：上述細(xì)胞用3%戊二醛固定后，PBS漂洗，1%鋨酸固定1h，經(jīng)包埋處理，超薄切片，在透射電鏡（TEM）下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。（2）瓊脂糖凝膠電泳成像：收集加入125I-UdR74KBq/ml+AUCG30M后

20、培養(yǎng)24h的C6細(xì)胞2×105個，2500rpm離心5min，去上清，加入裂解液，重懸細(xì)胞后，再加蛋白酶K消化30min，用等體積的平衡酚抽提兩次，加入2倍體積的冰乙醇置-202h，離心去上清，以75%的冰乙醇洗滌兩次后，加雙蒸水溶解DNA，取8l DNA溶液及上樣緩沖液2l上樣稀釋，用1.5%的瓊脂糖凝膠，電泳40min，將凝膠板在紫外光下，觀察照相。（3）流式細(xì)胞分析十四、內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型1、細(xì)胞因子損傷模型將內(nèi)皮細(xì)胞鋪板后待即將單層融合時，換無血清或低血清培養(yǎng)基，加入細(xì)胞因子如IL2，TNFalpha、IFN等，共同孵育一段時間，或者加入藥物與之共孵育，或者加細(xì)胞因子之前先加入

21、藥物孵育后，再加細(xì)胞因子，結(jié)束后測一些指標(biāo)如MTT、LDH、NO、等等看藥物對細(xì)胞因子損傷的保護(hù)作用。也可采用不同的時間、不同的濃度來觀察。2、缺氧再供氧損傷模型也是先將內(nèi)皮細(xì)胞鋪板后待即將單層融合時，換無血清或低血清培養(yǎng)基，先將細(xì)胞置于95N2和5的CO2的混合氣的缺氧槽環(huán)境中注意保持37度的溫度，用耗氧儀持續(xù)監(jiān)測缺氧槽中的氧分壓，使之保持在0.5 KP左右，細(xì)胞在低氧環(huán)境中培養(yǎng)一段時間后在移入正常的培養(yǎng)環(huán)境，可觀察不同的缺氧時間、不同的給氧時間對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)功能的影響，也可結(jié)合藥物觀察，入上所述。此外，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷模型尚有雙氧水損傷模型、氧自由基損傷模型、氧化型脂蛋白損傷模型、等等。最后

22、提及一點(diǎn)，樓上說的ox-LDL損傷模型的濃度不是很準(zhǔn)確，因為從目前國內(nèi)外的文獻(xiàn)來看，oxLDL（10-50ug/ml）的濃度一般不會損傷內(nèi)皮細(xì)胞尤其是內(nèi)皮細(xì)胞系，如ECV304，恰恰相反，的濃度的ox-LDL會促進(jìn)細(xì)胞的增值，國內(nèi)有人報道，ox-LDL造成ECV304凋亡的濃度一般為150ug/ml200ug/ml,也有用100g/ml的。十五、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的制備和培養(yǎng)1）取新生一周內(nèi)大鼠，碘酒、酒精浸泡消毒后快速斷頭；2）用眼科剪和鑷剪除皮膚和顱骨，分離皮膚和顱骨時用不同的器具，彎剪剪取部分大腦皮層至60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿內(nèi)提前放置D-Hanks溶液；3）解剖鏡下取出腦膜及血管，轉(zhuǎn)移組織至另一盛有D-Hanks溶液的器皿，將組織剪碎為1mm3左右的小塊，然后小心轉(zhuǎn)移至帶螺帽的離心管內(nèi)；4）0.125%胰酶消化15-30分鐘，以含10%胎（小）牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，巴氏吸管吹打，100目篩網(wǎng)機(jī)械過濾，制備混合細(xì)胞懸液；5）計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，根據(jù)需求按適當(dāng)密度種植于培養(yǎng)瓶或皿內(nèi)；6）放置于含5%CO2的37恒溫培養(yǎng)箱，2-3天后換液，去除死亡及未貼壁細(xì)胞，以后每3-4日換液一次；7）約兩周后當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿時可在培養(yǎng)液中