燈盞花對(duì)體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖的影響

1、燈盞花對(duì)體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖的影響羅啟賢1,2劉長(zhǎng)庚1,2(通訊作者)莫業(yè)躍1,2尹高權(quán)1,2(1廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V佛醫(yī)院510108； 2佛山市南海區(qū)第二人民醫(yī)院528251) 【中圖分類號(hào)】r78【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】1672-5085 (2012) 18-0051-03 【摘要】目的體外評(píng)價(jià)中草藥燈盞花對(duì)正常人體牙齦成纖維細(xì)胞增殖和量效關(guān) 系的影響。方法分離、培養(yǎng)正常人體牙齦成纖維細(xì)胞。將濃度為45、90、135、 180、225、270、315、360mg/l的燈盞花注射液分別作用于第5代正常人體牙齦 成纖維細(xì)胞，采用四哇鹽比色試驗(yàn)(mtt試驗(yàn))，檢測(cè)細(xì)胞的增殖，并測(cè)出各組

2、 的光吸度值(od值)。結(jié)果 與對(duì)照組od值相比，各燈盞花組隨濃度升高其 od值依次下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)o結(jié)論 中草藥燈盞花對(duì)體外培養(yǎng) 的人牙齦成纖維細(xì)胞有抑制作用，提示燈盞花有防止牙齦纖維化的作用。【關(guān)鍵詞】燈盞花牙齦成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖abstract objective： to study the effection of erigeron breviscapus(eb) on proliferation of human gingival fibroblast in vitro.methods: human gingival fibroblast was i

3、solated and primarily cultured in vitro.the 5th passage of fibroblast were plan ted in a 96-well culture plate.they were divided into 9 groups.according to eb concentration,0mg/l eb group(control group)>45mg/l eb group90mg/l eb group> 135mg/l eb group 180mg/l eb group 225mg/l eb group> 270m

4、g/l eb group> 315mg/l eb group and 360mg/l eb group.whe n all groups being in exp on ential phase of growth under microscope,they were dyed by mtt method and od(optical density) value of every well was detected by enzyme linked immunodetection meter.results: by contrast to od mean of control grou

5、p,from 45mg/l eb group to 360mg/l eb group,od mean of every group decreased step by step.conclusions: with some range of its concertration,eb could inhibit the proliferation of osteoblast in vitro,thus to hint that erigeron breviscapus can prevent the fibrosis of gingival.【key words erigeron brevisc

6、apus gingival fibroblast proliferation燈盞花，又名燈盞細(xì)辛，為一種活血化瘀類中草藥。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究發(fā) 現(xiàn)局部應(yīng)用燈盞花可通過促進(jìn)牙周膜和牙槽骨的改建及其中一些細(xì)胞因子的表 達(dá)，從而加速正畸牙移動(dòng)1-4,但局部應(yīng)用燈盞花是否會(huì)引起人體牙齦的變化, 目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，評(píng)價(jià)不同濃度燈盞花對(duì) 正常人體牙齦成纖維細(xì)胞增殖的影響。1材料和方法1.1人牙齦成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)正常人體牙齦組織塊取自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院口腔中心牙周科1例20 歲無全身系統(tǒng)性疾病和局部牙周病且無吸煙飲酒史的男性患者，經(jīng)患者知情同意 后，從需作牙冠延長(zhǎng)術(shù)的左側(cè)上

7、頜側(cè)切牙牙齦處切取正常健康牙齦組織，組織塊 用含抗生素的pbs液漂洗并修剪成小塊，用disperse酶（美國(guó)gibco公司產(chǎn)）消 化過液，撕去上皮層，置0.1%膠原酶（上海生物有限公司產(chǎn)）消化46h, 1000r 離心lomin,加入dmem培養(yǎng)基（美國(guó)gibco公司產(chǎn)，含10萬μ/l青霉素、 100mg/l鏈霉素、10%小牛血清）中，置5%co2培養(yǎng)箱中37°c培養(yǎng)，每3d更換 培養(yǎng)基，5d傳代一次，直至第5代。1.2不同濃度燈盞花干預(yù)不同吋間的mtt試驗(yàn)取上述培養(yǎng)的第5代人牙齦成纖維細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，按細(xì)胞 數(shù)為4×104/孔的細(xì)胞密

8、度接種到96孔培養(yǎng)板中，共分9組，每組10孔。 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，每板每組各孔培養(yǎng)基中分別加入0、45、90、135> 180、225、 270、315、360mg/l的燈盞花注射液（云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司產(chǎn)），在 顯微鏡下觀察各組細(xì)胞在接種后第4d吋生長(zhǎng)較快，此吋每孔加入5mg/ml的曝 卩坐藍(lán)（methyl thiazolyl terazoliumtt）溶液 20ul, 37°c孵育 4h 后吸去上清液， 每孔再加入150ul的二甲基亞颯（dimethyl sulphoxide,dmso）,震蕩10min,選 擇490nm波長(zhǎng)處在酶聯(lián)免疫儀上測(cè)定各孔光吸度（0d）值，記

9、錄結(jié)果。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，od值采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(+sd),組間比較采用t檢驗(yàn)，以p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2結(jié)果2.1體外培養(yǎng)的人體牙齦成纖維細(xì)胞形態(tài)原代培養(yǎng)第35d內(nèi)可見成纖維細(xì)胞從牙齦組織塊邊緣游岀，放射狀排 列向外生長(zhǎng)。至第5代吋，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，伸展良好，胞體豐滿，胞漿均勻(見 圖l)o圖1第5代原代培養(yǎng)的人體牙齦成纖維細(xì)胞2.2各藥物濃度組的od值及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理濃度分別為 45、90、135、180、225、270、315. 360mg/l 的燈盞花藥 物干預(yù)組與對(duì)照組比較的od值及其t值與p值結(jié)果見

10、表1。各組od值隨藥物 濃度的變化曲線見圖2o表1 各藥物濃度組與對(duì)照組比較的od值及其t值與p值3討論燈盞花注射液由產(chǎn)于我國(guó)西南部的一種菊科植物一短萃飛蓬的全草中 提煉出來的，性寒，微苦，具散寒解表、祛風(fēng)除溫、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、消炎 止痛等功效，臨床多用于心腦血管疾病。國(guó)內(nèi)學(xué)者劉侃、劉鴻虎、劉長(zhǎng)庚等14 先后證明燈盞花注射液能加速正畸牙移動(dòng)，正畸力合并局部應(yīng)用燈盞花注射液時(shí), 壓力側(cè)破骨發(fā)生及新生血管形成，同吋張力側(cè)成骨發(fā)生、膠原纖維和新生血管形 成，口牙周膜內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子陽(yáng)性表達(dá)。國(guó)內(nèi)學(xué)者周曾同等68通過系列實(shí)驗(yàn)證明燈盞花能通過上調(diào)

11、口腔粘膜局部α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-sma)表達(dá)水平、擴(kuò)張局部血管 和促進(jìn)微血管增生，從而預(yù)防口腔白斑、扁平苔鮮的癌變并減少頰囊癌的發(fā)生率。 但是有關(guān)燈盞花注射液對(duì)牙齦組織的影響國(guó)內(nèi)外均尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞，采用不同濃度的燈盞花注射液 進(jìn)行干預(yù)，從表1和圖2可見從45mg/l至360mg/l的燈盞花注射液隨濃度升高， 牙齦成纖維細(xì)胞的0d值呈線性下降，說明燈盞花對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的體外生長(zhǎng) 具有抑制作用，即具有預(yù)防牙齦纖維化的作用。同時(shí)從表1和圖2結(jié)果結(jié)合顯 微鏡下觀察還可看岀，當(dāng)燈盞花藥物濃度在270mg/l以下吋，0d值下降曲

12、線比 較平緩，藥物對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)只具抑制作用，尚無明顯毒性。但當(dāng)燈盞花藥 物濃度超過270mg/l時(shí)，藥物對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)不但具有抑制作用，還具有細(xì) 胞毒性作用，這吋鏡下可見已有部分成纖維細(xì)胞凋亡或死亡，圖2中0d值曲線 也呈急驟下降。國(guó)內(nèi)學(xué)者有報(bào)道燈盞花口服毒性小，但注射制劑在臨床應(yīng)用中個(gè)別 患者有不良反應(yīng)，其不良反應(yīng)可表現(xiàn)為高熱、寒戰(zhàn)、血疹、紫紂、呼吸窘迫、惡 心、頭昏、嘔吐、關(guān)節(jié)腫脹等變態(tài)反應(yīng)體征，但停藥或?qū)ΠY治療后癥狀消失。因 此，燈盞花注射劑在臨床應(yīng)用中還算比較安全的，但也應(yīng)掌握濃度，避免過高濃 度的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)劉侃，夏翔，潘勝利，等.中草藥(燈盞花)加速鼠牙移動(dòng)的實(shí)驗(yàn)研究.口腔醫(yī)學(xué),1992.12(2):17-19.劉泓虎，翁思恩,劉東旭，等離子導(dǎo)入與局部注射復(fù)方燈盞花加速兔牙移動(dòng)的實(shí) 驗(yàn)研究口腔醫(yī) 1995,15(4):169-171.劉侃，沈剛，胡國(guó)強(qiáng)離子導(dǎo)入燈盞花加速正畸牙移動(dòng)的臨床研究口腔正畸學(xué),1995,2(4):152-153.4劉長(zhǎng)庚，黃生高,凌天牖，等中草藥燈盞花對(duì)兔正畸牙移動(dòng)過程中牙周組織血管 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響華西口腔醫(yī)學(xué)雜志”2006,24:458461周曾同.燈盞細(xì)辛研究概況臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,200 1,17(3): 238-239.周曾同，張水龍,唐國(guó)瑤，等復(fù)方燈盞花對(duì)白斑、扁平苔鮮上皮異常增生的影響.上海 口腔醫(yī)