微生物培養(yǎng)、篩選與保存

1、一、復(fù)習(xí)二、微生物的生長曲線三、微生物的生長曲線的測定-方案匯報四、食品微生物檢測11.微生物菌種的保藏微生物菌種的保藏為什么要進(jìn)行菌種保藏菌種保藏的目的菌種保藏的原理菌種保藏的方法2 斜面低溫保藏法斜面低溫保藏法 石蠟油封藏法石蠟油封藏法 砂土管保藏法砂土管保藏法 麩皮保藏法麩皮保藏法 甘油懸液保藏法甘油懸液保藏法 冷凍真空干燥保藏法冷凍真空干燥保藏法 液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法 宿主保藏法宿主保藏法 2、菌種的復(fù)壯、菌種的復(fù)壯n 狹義的復(fù)壯狹義的復(fù)壯消極消極的措施的措施 指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純種指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從

2、已衰分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施?；謴?fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。n 廣義的復(fù)壯廣義的復(fù)壯積極積極的措施的措施 指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測定工就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個體。作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個體。菌種復(fù)壯的主要方法菌種復(fù)壯的主要方法1、純種分離法純種分離法 菌落純（菌落純（“菌種純菌種純”）細(xì)胞純（細(xì)胞純（“菌株純菌株純”

3、） 通過純種分離通過純種分離, ,可將衰退菌種細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典可將衰退菌種細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來型性狀的單細(xì)胞分離出來, ,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng), ,就可恢復(fù)原菌株的典型就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。性狀。平板表面涂布法平板表面涂布法平板劃線分離法平板劃線分離法瓊脂培養(yǎng)基澆注法瓊脂培養(yǎng)基澆注法用分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離用分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操作器進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操作器進(jìn)行單細(xì)胞分離菌絲尖端切割進(jìn)行單細(xì)胞分離菌絲尖端切割進(jìn)行單細(xì)胞分離任務(wù)一：認(rèn)識生長曲線的概念任務(wù)二：為生長曲線的繪制設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案7 什么是微生物的生長曲線什么是微生物的生長曲線將少量單

4、細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，測菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)每隔一定時間取樣，測菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長數(shù)目的對數(shù)為縱時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長數(shù)目的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。坐標(biāo)，繪制所得的曲線。910 將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期期四個階段。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的

5、曲線稱為該細(xì)菌的生長曲線生長曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。1112 哪些情況下需要測定微生物的生長哪些情況下需要測定微生物的生長 曲線？曲線？1.131. 任選大腸桿菌或酵母菌2.結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案，要求包括：（1）實(shí)驗(yàn)原理（2）材料與方法（3）預(yù)期結(jié)果15接下來請大家匯報實(shí)驗(yàn)方案本次的作業(yè)：請大家設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案，要求包括：（1）實(shí)驗(yàn)原理（2）材料與方法（3）預(yù)期結(jié)果A4紙打印上交四、食品微生物檢測一、食品微生物的檢驗(yàn)流程二、食品微生物樣品采集與制備三、食品微生物檢驗(yàn)1.食品中菌落總數(shù)檢測2.食品中霉菌和酵母

6、菌檢測四、制定實(shí)驗(yàn)方案19食品檢驗(yàn)的目的食品檢驗(yàn)的目的1.便于食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督管理；2.鑒別食品中是否存在有毒有害物質(zhì)3.為新產(chǎn)品、新資源利用、新食品等進(jìn)行衛(wèi)生鑒定一一.食品微生物檢驗(yàn)的一般步驟食品微生物檢驗(yàn)的一般步驟樣品采集樣品處理樣品保存選擇參考菌群檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備菌落總數(shù)大腸菌群致病菌分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)增菌純化染色鏡檢生化試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)動物試驗(yàn)結(jié)果報告二、食品微生物樣品采集與制備二、食品微生物樣品采集與制備取樣：代表性微生物檢驗(yàn)的取樣微生物檢驗(yàn)的取樣過程中，過程中，避免操作引起污染避免操作引起污染。一個無菌樣品的采集，應(yīng)該通過這樣一種方式，一個無菌樣品的采集，應(yīng)該通過這樣一種方式，即：即：在收

7、集過程中，本身應(yīng)避免污染，然后放在收集過程中，本身應(yīng)避免污染，然后放入消毒容器中入消毒容器中。22（一）（一） 檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備1.準(zhǔn)備好所需的各種儀器，如冰箱、水浴鍋、培養(yǎng)箱等。準(zhǔn)備好所需的各種儀器，如冰箱、水浴鍋、培養(yǎng)箱等。2.按技術(shù)要求將各種玻璃儀器進(jìn)行清洗、烘干、包扎、滅按技術(shù)要求將各種玻璃儀器進(jìn)行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無菌室備用。菌，冷卻后送無菌室備用。3.準(zhǔn)備好所用的各種試劑，制備營養(yǎng)瓊脂或其他培養(yǎng)基。準(zhǔn)備好所用的各種試劑，制備營養(yǎng)瓊脂或其他培養(yǎng)基。4.做好無菌室或超凈工作臺的滅菌工作，提前滅菌做好無菌室或超凈工作臺的滅菌工作，提前滅菌3050min.5.準(zhǔn)備好采

8、樣必需的工具和器材，如剪刀、鑷子、勺子等。準(zhǔn)備好采樣必需的工具和器材，如剪刀、鑷子、勺子等。6.采樣后樣品運(yùn)輸、保存相關(guān)準(zhǔn)備。采樣后樣品運(yùn)輸、保存相關(guān)準(zhǔn)備。（二）樣品的采集（二）樣品的采集采樣的步驟采樣的步驟采樣前調(diào)查采樣前調(diào)查現(xiàn)場觀察現(xiàn)場觀察確定采樣方案確定采樣方案采樣采樣 樣品封存樣品封存 開具采樣證明開具采樣證明采樣的原則采樣的原則1、根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?、食品特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、微生、根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?、食品特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、微生物的危害程度等確定采樣方案物的危害程度等確定采樣方案2、應(yīng)采用、應(yīng)采用隨機(jī)隨機(jī)原則，確保所采樣品必須具有原則，確保所采樣品必須具有代表性代表性。3、采樣操作必須遵循、

9、采樣操作必須遵循無菌無菌原則，要防止污染，防止變原則，要防止污染，防止變質(zhì)、損壞、丟失。質(zhì)、損壞、丟失。嚴(yán)格遵守樣品采集的操作規(guī)程。嚴(yán)格遵守樣品采集的操作規(guī)程。4、樣品在保存和運(yùn)輸過程中，應(yīng)采取措施、樣品在保存和運(yùn)輸過程中，應(yīng)采取措施防止防止樣品中樣品中原有微生物數(shù)量的變化，不得加入防腐劑、固定劑原有微生物數(shù)量的變化，不得加入防腐劑、固定劑等。等。 5、樣品采集和現(xiàn)場測定必須有二人以上參加、樣品采集和現(xiàn)場測定必須有二人以上參加 。食品微生物檢驗(yàn)的采樣方案食品微生物檢驗(yàn)的采樣方案微生物檢驗(yàn)的特點(diǎn)是一個以小份樣品的檢測結(jié)果來說明一大批微生物檢驗(yàn)的特點(diǎn)是一個以小份樣品的檢測結(jié)果來說明一大批食品衛(wèi)生質(zhì)

10、量，因此，用于分析的樣品的食品衛(wèi)生質(zhì)量，因此，用于分析的樣品的代表性代表性至關(guān)重要，也至關(guān)重要，也即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。要保證樣品的代表性首先要有要保證樣品的代表性首先要有一套科學(xué)的抽樣方案一套科學(xué)的抽樣方案，其次，其次使用使用正確的抽樣技術(shù)正確的抽樣技術(shù)，并在樣品的保存和運(yùn)輸過程中，并在樣品的保存和運(yùn)輸過程中保持樣品的原保持樣品的原有狀態(tài)有狀態(tài)。目前最為流行的抽樣方案為目前最為流行的抽樣方案為ICMSFICMSF推薦的抽樣方案和隨機(jī)抽樣方推薦的抽樣方案和隨機(jī)抽樣方案。無論采取何種方法抽樣，每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于案。

11、無論采取何種方法抽樣，每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于5 5件。件。對于需要檢驗(yàn)沙門氏菌的食品，抽樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不對于需要檢驗(yàn)沙門氏菌的食品，抽樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于少于8 8件。件。樣品的種類樣品的種類1.大樣，就是一整批；大樣，就是一整批；2.中樣，是從樣品中各部分取得的混合樣品，中樣，是從樣品中各部分取得的混合樣品，一般每批抽樣數(shù)量不少于一般每批抽樣數(shù)量不少于5件，一般為件，一般為200g；3.小樣，也稱檢樣，直接進(jìn)行分析用的，一般小樣，也稱檢樣，直接進(jìn)行分析用的，一般為為25g。食品微生物檢驗(yàn)的采樣方案食品微生物檢驗(yàn)的采樣方案ICMSF取樣方案；取樣方案；美國美國FDA的取樣方

12、案；的取樣方案；世界糧農(nóng)組織（世界糧農(nóng)組織（FAO）取樣方案；）取樣方案；我國的食品取樣方案。我國的食品取樣方案。ICMSF(The Intermational Committee onMicrobiological Specification for Food)國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會 食品微生物檢驗(yàn)采樣方法食品微生物檢驗(yàn)采樣方法采樣原則：采樣原則： 能采取完整包裝的樣品就不拆開能采取完整包裝的樣品就不拆開取樣，必須拆開包裝取樣的應(yīng)按無菌取樣，必須拆開包裝取樣的應(yīng)按無菌操作進(jìn)行取樣操作進(jìn)行取樣. .1、液體樣品采樣方法、液體樣品采樣方法 充分混勻后，無菌操作打開包裝，充分混勻后，無菌操作打開

13、包裝，用用100mL100mL無菌注射器抽取無菌注射器抽取, ,注入無菌盛注入無菌盛樣容器樣容器.2、半固體樣品采樣方法、半固體樣品采樣方法無菌操作打開包裝，用無菌勺子從幾無菌操作打開包裝，用無菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌容器。個部位挖取樣品，放入無菌容器。 3、固體樣品采樣方法、固體樣品采樣方法大塊整體食品用無菌刀具和鑷子從不同的部位割大塊整體食品用無菌刀具和鑷子從不同的部位割取，并注意其代表性；取，并注意其代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。放入無菌容器。若為檢驗(yàn)食品的污染情況，可取表層樣品；若為若為檢驗(yàn)食品的

14、污染情況，可取表層樣品；若為檢驗(yàn)食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。檢驗(yàn)食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。 4、冷凍食品采樣方法、冷凍食品采樣方法大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采??；大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采?。淮髩K冷凍食品可用無菌刀從不同部位削取或用無大塊冷凍食品可用無菌刀從不同部位削取或用無菌手鋸從凍塊上鋸取樣品，放入無菌容器。菌手鋸從凍塊上鋸取樣品，放入無菌容器。若為檢驗(yàn)食品污染情況，可取表層樣品；若為檢若為檢驗(yàn)食品污染情況，可取表層樣品；若為檢驗(yàn)食品品質(zhì)情況，應(yīng)從深部取樣。驗(yàn)食品品質(zhì)情況，應(yīng)從深部取樣。 5、生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣、生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣車間用水：從車間各龍頭采樣；車間用水：從車間各龍頭采

15、樣；車間臺面、用具、及加工售貨員手的衛(wèi)生監(jiān)測：車間臺面、用具、及加工售貨員手的衛(wèi)生監(jiān)測：用用5cm5cm2 2孔無菌采樣板和孔無菌采樣板和5 5支無菌棉簽擦拭支無菌棉簽擦拭25cm25cm2 2面面積，擦拭后立即用無菌剪刀將棉簽頭剪入無菌容積，擦拭后立即用無菌剪刀將棉簽頭剪入無菌容器中。器中。車間空氣采樣：將車間空氣采樣：將5 5個直徑個直徑90mm90mm的普通瓊脂平板分別的普通瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min5min，然后蓋蓋，然后蓋蓋送檢。送檢。平皿（七）采樣標(biāo)簽的填寫（七）采樣標(biāo)簽的填寫標(biāo)簽內(nèi)容主要：標(biāo)簽內(nèi)容主要： 編號、樣品名稱、生

16、產(chǎn)單位、生產(chǎn)日編號、樣品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)日期、產(chǎn)品批號、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、期、產(chǎn)品批號、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、采樣時間、采樣人姓名，現(xiàn)場情況。采樣時間、采樣人姓名，現(xiàn)場情況。采樣單采樣單 樣品編號：樣品編號：產(chǎn)品名稱（商品名）產(chǎn)品名稱（商品名）_規(guī)格型號規(guī)格型號_注冊商標(biāo)注冊商標(biāo)_生產(chǎn)廠家生產(chǎn)廠家_通訊地址通訊地址_郵政編碼郵政編碼 受檢地點(diǎn)受檢地點(diǎn)_通訊地址通訊地址_郵政編碼郵政編碼 采樣地點(diǎn)采樣地點(diǎn)_采樣日期采樣日期_采樣基數(shù)采樣基數(shù)_生產(chǎn)日期生產(chǎn)日期_批號批號_產(chǎn)品依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)_有效成分及含量有效成分及含量_檢驗(yàn)?zāi)康貦z驗(yàn)?zāi)康豞檢測項(xiàng)目檢測項(xiàng)目_ 采樣人仔細(xì)閱讀以下句子，然后簽

17、字我認(rèn)真負(fù)責(zé)地填寫了該樣品采樣單，承認(rèn)以上填采樣人仔細(xì)閱讀以下句子，然后簽字我認(rèn)真負(fù)責(zé)地填寫了該樣品采樣單，承認(rèn)以上填寫的合法性，被該采親單位所證實(shí)的樣品系按照采樣方法取得的，該樣品具有代表性、真實(shí)性和寫的合法性，被該采親單位所證實(shí)的樣品系按照采樣方法取得的，該樣品具有代表性、真實(shí)性和公正性。公正性。 代表單位（章）代表單位（章） 代表單位（章）代表單位（章） 簽字簽字 簽字簽字 日期年月日日期年月日 日期日期 年月日年月日 備注備注四四.樣品的送檢要求樣品的送檢要求 1 1、要快速運(yùn)送：不要超過要快速運(yùn)送：不要超過3小時；小時；2、若路途遙遠(yuǎn)，可在、若路途遙遠(yuǎn)，可在15低溫下運(yùn)送；低溫下運(yùn)送

18、；3、要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；、要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；4、要填寫檢驗(yàn)申請單。、要填寫檢驗(yàn)申請單。五五.樣品的處理方法樣品的處理方法（一）液體樣品（一）液體樣品（二）固體樣品（二）固體樣品（三）冷凍樣品（三）冷凍樣品（一）液體樣品的處理（一）液體樣品的處理1.瓶裝液體樣品的處理瓶裝液體樣品的處理2.盒裝或軟塑料包裝樣品的處理盒裝或軟塑料包裝樣品的處理1.瓶裝液體樣品的處理瓶裝液體樣品的處理 用點(diǎn)燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸用點(diǎn)燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸或來蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用滅菌開瓶器將或來蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用滅菌開瓶器將蓋啟開；蓋啟開；含有二氧化

19、碳的樣品可倒入含有二氧化碳的樣品可倒入500mL500mL磨口瓶內(nèi)，口勿磨口瓶內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣逸出后，取樣25mL25mL檢驗(yàn)。檢驗(yàn)。2.盒裝或軟塑料包裝樣品的處理盒裝或軟塑料包裝樣品的處理 將其開口處用將其開口處用75%75%酒精棉擦拭消毒，用滅菌剪子酒精棉擦拭消毒，用滅菌剪子剪開包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布在剪開包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布在剪開部分，直接吸取樣品剪開部分，直接吸取樣品25mL 25mL ，或傾入另一滅菌容，或傾入另一滅菌容器中再取樣器中再取樣25mL25mL檢驗(yàn)。檢

20、驗(yàn)。（二）固體樣品的處理（二）固體樣品的處理1.1.搗碎均質(zhì)法搗碎均質(zhì)法2.2.剪碎振搖法剪碎振搖法3.3.研磨法研磨法4.4.整粒振搖法整粒振搖法5.5.胃蠕動均質(zhì)法胃蠕動均質(zhì)法1.搗碎均質(zhì)法搗碎均質(zhì)法將中樣將中樣(100g)剪碎或攪拌混勻，從剪碎或攪拌混勻，從中取中取25g放入帶放入帶225mL稀釋液的無菌稀釋液的無菌均質(zhì)杯中，均質(zhì)杯中，800010000r/min均質(zhì)均質(zhì)12min即可。即可。視頻：無菌均質(zhì)器視頻：無菌均質(zhì)器2.剪碎振搖法剪碎振搖法將中樣將中樣(100g)(100g)剪碎或攪拌混勻，從中取剪碎或攪拌混勻，從中取25g25g檢樣進(jìn)檢樣進(jìn)一步剪碎，放入帶一步剪碎，放入帶225

21、mL225mL稀釋液和直徑稀釋液和直徑5mm5mm左右玻璃左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖5050次，振次，振幅要大于幅要大于40cm40cm。3.研磨法研磨法 將中樣將中樣(100g)(100g)剪碎剪碎或攪拌混勻，從中取或攪拌混勻，從中取25g25g檢樣放入無菌乳缽中充分檢樣放入無菌乳缽中充分研磨后，再放入帶有研磨后，再放入帶有225mL225mL無菌稀釋液的稀釋無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。4.整粒振搖法整粒振搖法直接稱取直接稱取25g25g整粒樣品置于帶有整粒樣品置于帶有225mL225mL稀釋液和稀釋液和直徑直徑5mm5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖用力快速振搖5050次，振幅要大于次，振幅要大于40cm40cm。（三）冷凍樣品（三）冷凍樣品冷凍樣品，先將中樣在冷凍樣品，先將中樣在04 下解凍，時間不能超下解凍，時間不能超過過18h，或在，或在45 下解凍，時間不能超過下解凍，時間不能超過15min。再取檢樣再取檢樣25g做稀釋處理。做稀釋處理。請大家參考p229 附錄五附錄五 中國食