實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用PPT

1、實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷 病原體測(cè)定 腫瘤診斷 基因差異表達(dá)研究 主要內(nèi)容4PCRPCR與基因診斷技術(shù)與基因診斷技術(shù) 基因診斷即通過核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)直接檢測(cè)基因的存在狀態(tài)或缺陷對(duì)疾病做出診斷的方法。 Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。 1998年，熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測(cè)。5熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒

2、光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。 熒光染料：SYBR Green I、EVA Green，ResoLight 熒光探針：TaqMan、Hybridization Probes、Molecular Beacon6羅氏應(yīng)用科學(xué)部整合細(xì)胞組學(xué)和基因組學(xué)的研究流程羅氏應(yīng)用科學(xué)部整合細(xì)胞組學(xué)和基因組學(xué)的研究流程LightCyclerLightCycler Real-Time PCR Platform Real-Time PCR Platform 超過十年的實(shí)時(shí)熒光超過十年的實(shí)

3、時(shí)熒光 PCR 的技術(shù)革新的技術(shù)革新 LightCycler 1.0Instrument32 320 Sample number Detection channels Sample volume l LightCycler 2.0Instrument32 620 / 100 LightCycler 1536Instrument1536 2 0.5 2 l1998199820032003 200920092005 / 20082005 / 2008 LightCycler 480 Instruments (I, II)96 / 384 5 / 610 - 100 / 5 - 20 LightCy

4、cler 480 LightCycler 480 廣泛的應(yīng)用廣泛的應(yīng)用 絕對(duì)定量絕對(duì)定量相對(duì)定量相對(duì)定量基于熔解曲線的基因分型基于熔解曲線的基因分型終點(diǎn)法基因分型終點(diǎn)法基因分型ATATAAAATTTT基于基于HRMHRM的突變掃描的突變掃描羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床診斷的整體解決方案基因診斷 病原體測(cè)定病原體測(cè)定 定性分析定性分析 絕對(duì)定量絕對(duì)定量 耐藥性研究耐藥性研究 腫瘤診斷 基因差異表達(dá)研究 主要內(nèi)容10熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)的臨床應(yīng)用技術(shù)的臨床應(yīng)用 病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測(cè) 性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測(cè) 優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目診斷：人巨

5、細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒II型（HSV）、風(fēng)疹病毒 其它病原體檢測(cè)：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等11HBV DNAHBV DNA檢測(cè)縮短檢測(cè)縮短“窗口期窗口期”PCR檢測(cè)“窗口期”核酸檢測(cè)縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷12熒光定量熒光定量PCRPCR方法檢測(cè)方法檢測(cè)HBVHBV感染的各期感染的各期血清標(biāo)本Copies/mlHBeAg陽性慢性乙型肝炎病人經(jīng)干擾素治療后HBeAg轉(zhuǎn)陰非活動(dòng)性HBsAg攜帶者血清原先血中HBV DNA陽性，已痊愈超過12個(gè)月的血清13乙肝

6、的治療乙肝的治療n 治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類： 干擾素：重組人-1b干擾素、 -2a、 -2b干擾素等 核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。14HBsAgHBsAg和和HBeAgHBeAg均陽性而均陽性而HBV DNAHBV DNA陰性？陰性？ 干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。 PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對(duì)結(jié)合。 病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBV DNA很少或缺乏。15抗病毒治療中存在的問題抗病毒治療中存在的問題 逆轉(zhuǎn)錄酶催化中心逆轉(zhuǎn)錄酶催化中心YMDDYMDD變變異異 YMDD：酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬

7、氨酸 蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟保↖）或纈氨酸（V）形成YIDD變異株或YVDD變異株16HBV-YMDDHBV-YMDD變異檢測(cè)的臨床意義變異檢測(cè)的臨床意義 動(dòng)態(tài)檢測(cè)：服用拉米夫定3個(gè)月開始，每月檢測(cè)1次 提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個(gè)月檢測(cè)出突變株 及時(shí)調(diào)整：適時(shí)調(diào)整用藥方案，防止因耐藥而導(dǎo)致病情惡化HRMHRM的應(yīng)用介紹的應(yīng)用介紹用用12 12 個(gè)個(gè)MIRUVNTR MIRUVNTR 位點(diǎn)對(duì)位點(diǎn)對(duì)結(jié)核桿菌菌株結(jié)核桿菌菌株進(jìn)行基因分型進(jìn)行基因分型Yu Pang et al Journal of Microbiological Methods 2011in press不同不同MIRU

8、40 MIRU40 位點(diǎn)重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)品的位點(diǎn)重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)品的HRM HRM 分析結(jié)果分析結(jié)果 . R=repeat. R=repeat8888個(gè)菌株不同個(gè)菌株不同MIRU40 MIRU40 數(shù)量的數(shù)量的Tm Tm 值的統(tǒng)計(jì)值的統(tǒng)計(jì)流行病學(xué)研究流行病學(xué)研究18小結(jié)小結(jié) 熒光定量PCR可以對(duì)致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測(cè) 彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷（如HCV） 縮短診斷的窗口期（如HIV），利于早期診斷 對(duì)治療過程進(jìn)行療效監(jiān)測(cè) 指導(dǎo)用藥過程及劑量，以制定合理的療效方案 結(jié)合臨床表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)的免疫學(xué)、影像學(xué)等診斷方法來綜合評(píng)判，更為科學(xué)。羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷 病原體測(cè)定 腫瘤診斷腫瘤診斷

9、 突變檢測(cè)突變檢測(cè)個(gè)性化用藥個(gè)性化用藥 甲基化 基因差異表達(dá)主要內(nèi)容高分辨率熔解曲線高分辨率熔解曲線定義定義高分辨率熔解曲線高分辨率熔解曲線(HRM)(HRM)是傳統(tǒng)的熔解曲線分析的延伸是傳統(tǒng)的熔解曲線分析的延伸: : 它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR儀器與專門的分析算法 分辨率高，可以區(qū)分一個(gè)堿基突變的多組核酸樣本，可以區(qū)分野生型（純合子）、突變型（純合子），雜合子 使我們可以不必測(cè)序直接篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在遺傳學(xué)變異 (SNPs, mutations) 與其它方法相比，具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優(yōu)點(diǎn)；而且通量更高，單次成本更低！HRMHRM的應(yīng)用的應(yīng)用 SNP

10、SNP 位點(diǎn)的檢測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè) ( (已知與未知位點(diǎn)已知與未知位點(diǎn)) ) 單倍型分析，雜合性喪失的篩查單倍型分析，雜合性喪失的篩查, , 種群中優(yōu)勢(shì)等位基因分析，物種群中優(yōu)勢(shì)等位基因分析，物種鑒定種鑒定, DNA, DNA遺傳作圖，潛在易感基因的篩選遺傳作圖，潛在易感基因的篩選 醫(yī)學(xué)應(yīng)用：產(chǎn)前診斷，傳染病與遺傳疾病的監(jiān)控，藥物療效的觀察醫(yī)學(xué)應(yīng)用：產(chǎn)前診斷，傳染病與遺傳疾病的監(jiān)控，藥物療效的觀察 突變，包括小片段的插入和缺失突變，包括小片段的插入和缺失 醫(yī)學(xué)應(yīng)用：腫瘤的快速診斷醫(yī)學(xué)應(yīng)用：腫瘤的快速診斷, , 治療與預(yù)后評(píng)價(jià)治療與預(yù)后評(píng)價(jià) 甲基化應(yīng)用甲基化應(yīng)用 醫(yī)學(xué)應(yīng)用：腫瘤的快速診斷醫(yī)學(xué)應(yīng)用：腫瘤

11、的快速診斷, , 治療與預(yù)后評(píng)價(jià)治療與預(yù)后評(píng)價(jià)飽和熒光染料飽和熒光染料創(chuàng)新的飽和熒光染料創(chuàng)新的飽和熒光染料能夠識(shí)別單堿基突變能夠識(shí)別單堿基突變, , 并且不抑制并且不抑制PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)不飽和雙鏈不飽和雙鏈DNADNA熒光染料熒光染料SYBR Green ISYBR Green I純合子和雜合子的熔解曲線基本相同純合子和雜合子的熔解曲線基本相同飽和雙鏈飽和雙鏈DNADNA熒光染料熒光染料ResoLightResoLight、LCGreenLCGreen、EvaGreenEvaGreen都為綠色熒光染料，最佳激發(fā)波長范圍都為綠色熒光染料，最佳激發(fā)波長范圍440-440-470nm470nm，

12、發(fā)射熒光波長，發(fā)射熒光波長470-520nm470-520nm。序列的變化會(huì)導(dǎo)致熔解曲線的顯著變化序列的變化會(huì)導(dǎo)致熔解曲線的顯著變化純合子純合子雜合子雜合子VSVSvsvs創(chuàng)新的創(chuàng)新的HRM染料準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子和雜合子染料準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子和雜合子LC480 HRM Master Mix ResoLight Dye SYBR Green I vsLightCycler 480 ResoLight Dye后者提供更高的信號(hào)靈敏度和分后者提供更高的信號(hào)靈敏度和分辨率辨率24HRMHRM技術(shù)和技術(shù)和dHPLCdHPLC的分辨率比較的分辨率比較dHPLCdHPLCHRMHRMwtmuthetwt

13、wtwtwtwtmutmutmutmutmutwthetno separation ofno separation of homozygous homozygous variantvariant FAB Ex15J, 318 bp amplicon, SNP A/GPCRPCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于基因掃描的基因分型基于基因掃描的基因分型DNA withheterocygoteSNPPCR+ . . .TCTTTTTCCCCCGAAAAAAGGGGGDenaturationreannealing+IntercalatingfluorescentdyeIncreasin

14、gtemperature26Melting CurvesTemperatureCGTA兩種同源雙鏈兩種同源雙鏈兩種異源雙鏈兩種異源雙鏈CATG觀察到的觀察到的4 4種種雙鏈結(jié)構(gòu)雙鏈結(jié)構(gòu)雜合子擴(kuò)增雜合子擴(kuò)增基因基因掃描掃描高分辨率熔解分析高分辨率熔解分析 純合子野生型(homoduplexes)純合子突變 型(homoduplexes)雜合子案例:LPLH3基因的突變 (SNP CT)72樣品，PCR產(chǎn)物大小164 bpLightCyclerLightCycler 480 HRM 480 HRM 應(yīng)用介紹應(yīng)用介紹基因掃描基因掃描 顯著降低測(cè)序成本顯著降低測(cè)序成本 甘露糖結(jié)合凝集素MBL2基因序列

15、變異分析 (384 個(gè)樣本, 擴(kuò)增子長度219 bp): 4種最常見的基因型在圖像上被分為4組; 少量樣本呈現(xiàn)另外的3種遺傳變異29突變定量分析： CYP2C9目前約有16%的臨床藥物由其負(fù)責(zé)代謝(如華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因)portion T portion T alleleallele50%, 1:120%, 1:514%, 1:7 10%, 1:10 4%, 1:250%144 bp amplicon, SNP C/T30凝血因子VIII的突變檢測(cè)第八因子的單堿基替換導(dǎo)致了 50% 急性血友病A。由于該基因轉(zhuǎn)錄本長達(dá)9kb，且外顯子較小（69262 bp)，利用dHPLC 或者測(cè)序檢測(cè)

16、昂貴耗時(shí)。用HRM可篩選出90%的突變。Detection of Factor VIII Gene Mutations by High-Resolution Melting Analysis. Laurie et al. Clin Chem. 200731HRMHRM法檢測(cè)法檢測(cè)KRASKRAS基因的敏感性結(jié)果基因的敏感性結(jié)果擴(kuò)增片段92bp，突變型質(zhì)粒所占的比例分別為0%、2%、5%、10%、20%、50%、100% 的混合質(zhì)粒DNA系列中，HRM分析方法可以明顯的檢測(cè)出只含2%的突變型DNA。50%20%100%10%5%WT2%14%32不同的不同的KRASKRAS突變類型在突變類型在H

17、RMHRM判讀圖譜中顯示出與野生型判讀圖譜中顯示出與野生型不同的突變型的曲線不同的突變型的曲線羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷 病原體測(cè)定 腫瘤研究腫瘤研究 突變檢測(cè) 甲基化檢測(cè)甲基化檢測(cè) 基因差異表達(dá)研究主要內(nèi)容34 在一般正常的細(xì)胞中，CpG成分處于非甲基化的狀態(tài) 甲基化研究對(duì)于了解基因的調(diào)控模式以及疾病的分子生物學(xué)機(jī)制具有重要 意義：發(fā)育、癌腫瘤發(fā)生、基因印跡、X 染色體失活及相關(guān)遺傳性疾病 在特定條件下，譬如許多發(fā)育相關(guān)基因，在發(fā)育的特殊階段去甲基化表達(dá) 腫瘤的DNA甲基化改變表現(xiàn)為總體的甲基化水平降低與啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平升高。抑癌基因與修復(fù)基因的甲基化導(dǎo)致抑癌

18、基因沉默與修復(fù)基因失活; 而總體低甲基化使反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、癌基因活化和染色體不穩(wěn)定基于甲基化特定標(biāo)志物的量化情況，對(duì)不同的病人進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)水平分級(jí)DNA DNA 甲基化現(xiàn)象和疾病研究甲基化現(xiàn)象和疾病研究2. PCR 擴(kuò)增，脲嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后變?yōu)樾叵汆奏?，使甲基化差別轉(zhuǎn)換為堿基序列差別TCmCU1. 重硫酸鹽處理已變性的DNA，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)殡遴奏CmCCU3. 分析: 測(cè)序，甲基化特異性PCR， 引物延伸，限制性酶消化， 雜交 or Real-time PCR!DNA DNA 甲基化研究的常規(guī)流程甲基化研究的常規(guī)流程36High Quality Assessment of DNA Met

19、hylation in Archival Tissues from Colorectal Cancer Patients Using Quantitative High-Resolution Melting Analysis. Balic, M. et al. (2009), J. Mol. Diagn. 11, 102-108.在腫瘤發(fā)生過程中，超甲基化的啟動(dòng)是一個(gè)常見的抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，它也同時(shí)被視為腫瘤發(fā)生的特點(diǎn)之一。適當(dāng)保存的組織是檢測(cè)重要的生物標(biāo)志物的重要來源。在早期癌癥監(jiān)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)分析和治療中，DNA甲基化分析方法是一個(gè)理想的手段。使用使用HRMHRM分析方法，可以穩(wěn)定地檢分析方法

20、，可以穩(wěn)定地檢測(cè)到測(cè)到1%1%的甲基化的甲基化DNADNA37甲基轉(zhuǎn)移酶MGMT與腫瘤預(yù)見性、個(gè)體化治療Krypuy, M. et al. Rapid high-throughput methylation analysis using the LightCycler 480 system. Biochemica 1 1, 1113; 2008 O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MGMT，是細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的一種酶，可以修復(fù)由各種烷化劑造成的細(xì)胞DNA烷基化損傷細(xì)胞中的MGMT水平?jīng)Q定了細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥程度MGMT的甲基化程度直接反映了其表達(dá)水平羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷

21、 病原體測(cè)定 腫瘤診斷 基因基因差異差異表達(dá)研究表達(dá)研究 早期篩查早期篩查 分子指紋分子指紋主要內(nèi)容qPCRqPCR圖譜作為腫瘤指紋用于早期篩查圖譜作為腫瘤指紋用于早期篩查早期篩查早期篩查腫瘤的惡性生長會(huì)引起血液生化環(huán)境的特征性變化，這些變化將會(huì)影響血細(xì)胞某些基因的表達(dá)。根據(jù)不同腫瘤與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，對(duì)外周血細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行人類全基因的表達(dá)差異分析（生物芯片），篩選出腫瘤相關(guān)表達(dá)差異基因。 乳腺癌早期診斷乳腺癌早期診斷（熒光定量PCR法）：通過對(duì)外周血細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行人類全基因組的表達(dá)差異分析，篩選乳腺癌早期診斷的基因標(biāo)記物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)臨床血液樣本中乳腺癌標(biāo)志物的表達(dá)差異

22、，檢測(cè)結(jié)果可用于乳腺癌的早期篩查和輔助診斷。qPCRqPCR圖譜作為圖譜作為成神經(jīng)細(xì)胞瘤成神經(jīng)細(xì)胞瘤指紋指紋Predicting outcomes for children with neuroblastoma using a multigene-expression signature. Vermeulen, J. et al. (2009), Lancet Oncol. 10, 663-671. 在最大的成神經(jīng)細(xì)胞瘤庫（n=579）中建立、驗(yàn)證了大量的預(yù)后多基因表達(dá)。 實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR) 檢測(cè)，只需20ng RNA，使用59種預(yù)后基因和5種內(nèi)參基因。 這個(gè)驗(yàn)證結(jié)果構(gòu)成的“指紋信息

23、”可以作為一種獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)機(jī)制，使得在當(dāng)前的治療組中能鑒別出病情可能加重的病人。41多因子疾病治療預(yù)后多因子疾病治療預(yù)后A multiplex real-time PCR method for detection of GSTM1 and GSTT1 copy numbers. Timofeeva, M. et al. (2009), Clinical Biochemistry 42, 500-509. 對(duì)于致癌物質(zhì)解毒和藥物代謝，谷胱甘肽結(jié)合十分重要。 人體中大量的GSTT1 和 GSTM1 發(fā)生缺失。 GST基因缺失的多樣性對(duì)于多因子疾病，例如不同類型的癌癥，有潛在的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)見因素。 在

24、LightCycler 480 上使用多重PCR反應(yīng)對(duì)GSTM1 和 GSTT1進(jìn)行基因分型，內(nèi)參基因?yàn)閍lbumin。 所有的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)化比例使用LightCycler 480 軟件進(jìn)行相對(duì)定量。 這種新的半定量基因分型方法具有高靈敏度，是大型分子流行病和臨床研究的理想工具。42European Space Agency Mission European Space Agency Mission 歐洲航天計(jì)劃歐洲航天計(jì)劃 宇航員的基因表達(dá)在太空旅行前后是否有變化？宇航員的基因表達(dá)在太空旅行前后是否有變化？ GPCRs通過cMAP介導(dǎo)的信號(hào)通路影響免疫學(xué)功能 樣本來源：進(jìn)入外太空前后的宇航員

25、血樣 UPL通用探針庫讓您更快地從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到開始實(shí)驗(yàn) Roche: 1 day Roche: 1 day Others: 2 weeks Others: 2 weeks43外太空環(huán)境對(duì)免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá)的影響外太空環(huán)境對(duì)免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá)的影響 Changes in expression Changes in expression patternpattern before and after trip before and after trip to the ISSto the ISS (RealTime ready GPCR panel)Data kindly distribute

26、d from Dr.Dr. S. Kreth,PD Dr. A. Chouker, and Prof. Dr. M. Thiel, LMU Munich/Germany;(ESA Project (ESA Project IMMUNO)IMMUNO)出發(fā)前, 返回后1, 7, 30天分別進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)5位宇航員的基因表達(dá)水平檢測(cè)到顯著差異10fold 10fold downregulatdownregulateded10fold 10fold upregulatedupregulatedUPLUPL通用探針庫讓您更快地從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通用探針庫讓您更快地從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到開始實(shí)驗(yàn)到開始實(shí)驗(yàn) Roche:

27、 1 day Roche: 1 day Others: 2 weeks Others: 2 weeks Mechanism of actionMechanism of action44RealTime RealTime readyready Human GPCR Panel Human GPCR Panel宇航員在進(jìn)入外太空前后血樣中的基因表達(dá)變化宇航員在進(jìn)入外太空前后血樣中的基因表達(dá)變化Gene 1Gene 2Gene 3Gene 4Gene 5Gene 6Gene 7Gene 8Gene 9Gene 10Gene 11Gene 12Gene 13Gene 14Gene 15Gene 16P1R1R2R3P1R1R2R3P1R1R2R3P1R1R2R3相對(duì)定量檢測(cè)多個(gè)基因在血液中表達(dá)量的變化：進(jìn)入外