MAPK信號(hào)通路presentation

1、王德美2014.12.17淀粉樣前體蛋白淀粉樣前體蛋白(APP)(APP)的突變?cè)诘耐蛔冊(cè)诘矸蹣佣嚯模ǖ矸蹣佣嚯模ˋ）形成過(guò)程中作形成過(guò)程中作用研究用研究?jī)?nèi)容概要研究背景研究思路及核心技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)展望內(nèi)容概要研究背景研究背景研究思路及核心技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)41.1 1.1 阿爾茨海默癥阿爾茨海默癥（Alzheimers disease, AD）1906年報(bào)道1例51歲女性患者，進(jìn)行性記憶和語(yǔ)言能力喪失及識(shí)別能力障礙，病情逐漸惡化、4年半后死亡，病解發(fā)現(xiàn)腦萎縮、老年斑和神經(jīng)原纖維改變。65-69 70-74 75-79 80-84 85-89 90-94 95-99年齡年齡 (年年)5病理特征：淀粉樣蛋白

2、沉積淀粉樣蛋白沉積形成的細(xì)胞外老年斑老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)。老年斑神經(jīng)元纖維纏結(jié)61.2 1.2 淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)Amyloid cascade hypothesisneurodegenerationFomation of brain oligomeric A or deposition of fibrillar A accumulationAmyoid precursor protein(APP)Pathogenesis：increased，altered production or reduced clearance of Ahere

3、ditary factorenvironmental factor- secretase- secretaseA（observed in the brain of patients with ADAD and SAD）APP 淀粉樣前體蛋白A 淀粉樣多肽- secretase 分泌酶- secretase 分泌酶APPC83APP水解途徑水解途徑非淀粉樣途徑：被-分泌酶（C83）和-分泌酶連續(xù)切割淀粉樣途徑 ：A的產(chǎn)生，被-分泌酶（C99）（670Met671Asp之間）和分泌酶依次切割A(yù)PP是一種跨膜蛋白質(zhì),在體內(nèi)各種組織廣泛存在,而在腦組織的表達(dá)最高。8APP水解途徑水解途徑分泌酶水解67

4、0Met671Asp之間的肽鍵，將APP一分為二，生成670個(gè)氨基酸的APP片段和帶完整A的跨膜C段。l非淀粉樣途徑：被-分泌酶（C83）和-分泌酶連續(xù)切割l淀粉樣途徑 ：A的產(chǎn)生，被-分泌酶（C99）和分泌酶依次切割課題選取的5個(gè)APP突變突變位點(diǎn)突變位點(diǎn)氨基酸殘基替換氨基酸殘基替換突變命名突變命名發(fā)現(xiàn)時(shí)間發(fā)現(xiàn)時(shí)間673AT冰島人突變2012年NatureAV2009年Science682EK2011年693EG北極人突變2001年Nature NeuroscienceEQ荷蘭人突變1990年Science選取理由：2個(gè)早期發(fā)現(xiàn)突變E693G和E693Q，剩余3個(gè)為近些年發(fā)現(xiàn)的突變。對(duì)比研究

5、。app基因基因堿基序列堿基序列突變位點(diǎn)突變位點(diǎn)堿基替堿基替換換APP蛋白氨蛋白氨基酸序列突基酸序列突變位點(diǎn)變位點(diǎn)密碼子改變密碼子改變氨基酸替氨基酸替換換密碼子名稱(chēng)密碼子名稱(chēng)2217GA673GCAACAAT丙氨酸蘇氨酸2218CT673GCAGUAAV丙氨酸纈氨酸2244GA682GAAAAAEK谷氨酸賴(lài)氨酸2278AG693GAAGGAEG谷氨酸甘氨酸2277GC693GAACAAEQ谷氨酸谷氨酰胺內(nèi)容概要研究背景研究思路及核心技術(shù)研究思路及核心技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)展望 表征： APP level C99 level A level本課題選取5個(gè)APP突變，研究不同APP突變對(duì)A形成過(guò)程的不同作用2

6、.1 研究出發(fā)點(diǎn) 2.2.1 構(gòu)建BACE1 穩(wěn)轉(zhuǎn) HEK293 細(xì)胞株 2.2.2 突變構(gòu) 2.2.3 轉(zhuǎn)染 2.2.4 檢測(cè) 建APP突變基因真核表達(dá)載體構(gòu)建APP突變基因真核表達(dá)載體2.2 設(shè)計(jì)思路及核心技術(shù)2.2.1 構(gòu)建構(gòu)建BACE1 穩(wěn)轉(zhuǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn) HEK293 細(xì)胞株細(xì)胞株 2.2.2 突變構(gòu) 2.2.3 轉(zhuǎn)染 2.2.4 檢測(cè) 建APP突變基因真核表達(dá)載體構(gòu)建APP突變基因真核表達(dá)載體2.2 設(shè)計(jì)思路及核心技術(shù) 2.2.1 構(gòu)建BACE1 穩(wěn)轉(zhuǎn) HEK293 細(xì)胞株2.2.2 突變突變構(gòu) 2.2.3 轉(zhuǎn)染 2.2.4 檢測(cè) 建APP突變基因真核表達(dá)載體構(gòu)建APP突變基因真核表達(dá)載體2

7、.2 設(shè)計(jì)思路及核心技術(shù)APP基因序列重疊延伸法PCR引入突變位點(diǎn)pcDNA4A+BC+D 采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)的技術(shù)。重疊延伸PCR在基因的定點(diǎn)突變中具有重要應(yīng)用。引物設(shè)計(jì)兩端引物兩端引物APP(F)AAACAAGCTTGCCACCATGCTGCCCGGTTTGAPP(R)CCCCGCTAGTCTAGAGTTCTGCATCTGCTCAA突變點(diǎn)引物APPA673T(F)GAAGTGAAGATGGATACAGAATTCCGACATGACAPPA673T(R)GTCATGTCGGAATTCTGTA

8、TCCATCTTCACTTCAPPA673V(F)gaagtgaagatggatgtagaattccgacatgac APPA673V(R)gtcatgtcggaattctacatccatcttcacttcAPPE682K(F)ccgacatgactcaggatacaaagttcatcatcaa APPE682K(R)ttgatgatgaactttgtatcctgagtcatgtcggAPPE693G(F)ggtgttctttgcaggagatgtgggttcaaacAPPE693G(R)gtttgaacccacatctcctgcaaagaacaccAPPE693Q(F)ggtgttctttg

9、cacaagatgtgggttcaaacAPPE693Q(R)gtttgaacccacatcttgtgcaaagaacacc20重疊延伸法重疊延伸法PCR結(jié)果結(jié)果突變及檢驗(yàn)突變及檢驗(yàn)MarkerDNA Ladder2.3kb 雙酶切結(jié)果雙酶切結(jié)果5.0kb2.1kb A673T A673V E682K E693G E693QAPP WTA673TA673VE682KE693GE693QpcDNA4雙酶切驗(yàn)證結(jié)果雙酶切驗(yàn)證結(jié)果成功構(gòu)建5個(gè)APP突變基因真核表達(dá)載體。野生APP基因約為2.3kb，pcDNA4為5.1kb，選用內(nèi)切酶為Hind和Xba，下圖為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（酶切后兩片段約為2.

10、1kb和5.0kb）：重組檢驗(yàn)自左向右：1為Maker；2、3為APPA673T；4、5為APPA673V;6、7為APPE682K;8、9為APPE693G;10、11為APPE693Q。其中，2、3、4、6、7、8、9、10、11為陽(yáng)性結(jié)果。說(shuō)明成功構(gòu)建APP突變基因真核表達(dá)系統(tǒng)。 2.2.1 構(gòu)建BACE1 穩(wěn)轉(zhuǎn) HEK293 細(xì)胞株 2.2.2 突變構(gòu)2.2.3 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 2.2.4 檢測(cè) 建APP突變基因真核表達(dá)載體構(gòu)建APP突變基因真核表達(dá)載體2.2 設(shè)計(jì)思路及核心技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 2.2.1 構(gòu)建BACE1 穩(wěn)轉(zhuǎn) HEK293 細(xì)胞株 2.2.2 突變構(gòu) 2.2.3 轉(zhuǎn)染2.2.4 檢測(cè)檢測(cè) 建APP突變基因真核表達(dá)載體構(gòu)建APP突變基因真核表達(dá)載體2.2 設(shè)計(jì)思路及核心技術(shù)檢測(cè)APP、C99和AWestern Blot 、 ELlSA 、質(zhì)譜APPC83APP水解途徑水解途徑非淀粉樣途徑：被-分泌酶（C83）和-分泌酶連續(xù)切割淀粉樣途徑 ：A的產(chǎn)生，被-分泌