常見的PCR添加劑(共13頁)

1、PCR添加劑是PCR反應(yīng)中的一種增效劑，它們在PCR反應(yīng)中起到提高PCR反應(yīng)的特異性、增加PCR擴增的產(chǎn)量及防止無效擴增等有益效果。由于PCR技術(shù)在有些情況下擴增的不完美性，從PCR技術(shù)發(fā)明的初期開始，人們就展開了對PCR反應(yīng)中添加其它化學物質(zhì)的研究。迄今為止，在PCR添加劑的研究領(lǐng)域，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的PCR添加劑，它們都以各自的特性在不同的方面對PCR反應(yīng)起著促進作用。而隨著PCR添加劑研究的不斷發(fā)展，在各種相關(guān)研究中，人們逐漸從研究和應(yīng)用單一型PCR添加劑轉(zhuǎn)向研究和應(yīng)用復(fù)合型PCR添加劑，從傳統(tǒng)PCR添加劑的研究開發(fā)轉(zhuǎn)向新材料新化合物PCR添加劑的研究開發(fā)。傳統(tǒng)的PCR添加劑包括常

2、見的助溶劑、離子化和非離子化的除垢劑以及一些諸如氯化四甲基銨（TMAC）、甜菜堿、SSB等。多年來人們對這些添加劑的研究表明，它們在一定的濃度范圍內(nèi)對某些PCR有著增效作用，但在另外一些情況下或在其它的濃度范圍內(nèi)對PCR反應(yīng)又有著抑制作用，所以這些PCR添加劑的在不同反應(yīng)體系中的應(yīng)用應(yīng)通過試驗來調(diào)整和合理選擇，合理準確的使用會使PCR反應(yīng)獲得很大的改善，從而得到試驗所需要的理想結(jié)果。甜菜堿是一種高效的甲基受體，它在一些細菌體內(nèi)對抵抗因鹽份引起的滲透壓升高起著重要的作用，其做為一種PCR添加劑，出現(xiàn)在Rees.W.A.22等人對甜菜堿降低DNA 的Tm所做的研究之后。甜菜堿廣泛存在于多種酶以及P

3、CR試劑盒中，它能提高PCR擴增的效率和特異性，特別是在長PCR（Long-PCR）擴增時常被應(yīng)用23。Barnes23指出，在LongPCR中添加甜菜堿能夠使每個循環(huán)的熱變性溫度下降到9293，且退火溫度也可以下降12，從而補償因退火條件變化及因其它添加劑引起的酶穩(wěn)定性下降引起的PCR反應(yīng)的負面效果。另外，他還指出甜菜堿不僅能促進高GC含量片段的擴增，而且能提高普通的PCR擴增的目的產(chǎn)物量24。甜菜堿另外一個優(yōu)點是，作為一種滲透保護劑，它具有和牛血清白蛋白（BSA）類似的功能，能夠防止聚合酶的變性24。把LongPCR Buffer中的BSA換成甜菜堿將有利于減少彌散問題的發(fā)生。甜菜堿也有可

4、以克服DNA少量污染帶來的擴增困難，這意味著PCR反應(yīng)可以在低質(zhì)量模板存在的情況下進行25。氯化四甲基銨（TMAC）最早被用于在雜交反應(yīng)中減少DNARNA的錯配以提高特異性26，在PCR反應(yīng)中，它能夠增加PCR反應(yīng)的效率和提高PCR反應(yīng)的特異性。在Ted Hung等人27首次發(fā)現(xiàn)TMAC提高PCR反應(yīng)特異性的研究中，他們選擇了兩個mouse cDNA的基因片段進行擴增實驗。結(jié)果顯示，含有1×10-51×10-4 M TMAC的實驗組擴增結(jié)果在電泳圖上只出現(xiàn)一條單一的目的條帶，而未含有TMAC的實驗組特異性非常差，有多條非目的條帶出現(xiàn)。Eric Chevet等人28在研究中還

5、發(fā)現(xiàn)，通過添加TMAC可以提高AT含量豐富的DNA片段的Tm，從而通過改善引物的特異性結(jié)合來提高PCR反應(yīng)的特異性。在研究中，他們實驗了不同濃度的TMAC促進PCR反應(yīng)的效果，發(fā)現(xiàn)TMAC的最佳添加濃度為60mM。他們的研究還表明，TMAC不僅可以提高PCR反應(yīng)的特異性，而且可以提高PCR反應(yīng)的效率，三對引物的擴增實驗均發(fā)現(xiàn)添加TMAC可以提高PCR目的產(chǎn)物產(chǎn)量510倍。單鏈結(jié)合蛋白（SSB）是活的生物體中不可缺少的重要物質(zhì)，它非特異性的和單鏈DNA結(jié)合，參與所有涉及到單鏈DNA的諸如復(fù)制，修復(fù)及重組等過程29。這種體內(nèi)DNA復(fù)制過程中SSB所起到的重要作用，自然引起了人們對SSB在PCR這一

6、體外DNA 復(fù)制技術(shù)中應(yīng)用的可行性考慮。Rapley等人30在1994年首次就SSB在PCR中的應(yīng)用做了專門研究。他們研究發(fā)現(xiàn)T4噬菌體基因32編碼蛋白及大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白對數(shù)種模板的PCR反應(yīng)均有提高效率的作用。由于PCR反應(yīng)是一個不斷的熱循環(huán)過程，因此嗜熱源SSB是PCR添加劑的理想來源，這一點在近年來的研究中得到了證實。Dbrowski等12就曾克隆Thermus aquaticus 和 T.thermophilus的SSB編碼基因并讓它們在E. coli中過表達，隨后進行的Taq SSB及Th SSB在PCR中的添加實驗表明它們均能很好的提高PCR反應(yīng)效率。之后不久，Perales等

7、人13表達純化了三種類型ThSSB，在Th聚合酶和Pfu聚合酶的PCR體系中所做的實驗發(fā)現(xiàn)ThSSB可以使PCR延伸的時間減半，而且在無校正功能的Th聚合酶PCR體系中的實驗進一步表明ThSSB可以增加PCR反應(yīng)的保真度。而Olszewski等人14在multiplex PCR 實驗中對TaqSSB的研究發(fā)現(xiàn)其可以防止或減少引物二聚體的形成，從而有效提高PCR反應(yīng)的效率和特異性。甲酰胺（Formamide）是被較早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用的PCR添加劑之一，它能顯著性的提高PCR反應(yīng)的特異性8。為了開發(fā)新的更高效的PCR增效劑，Raj Charabarti等人31對與甲酰胺結(jié)構(gòu)類似的低分子量的胺類化合物

8、在PCR中的應(yīng)用做了專門的研究。在Raj Charabarti等人的研究中，包括甲酰胺在內(nèi)的與甲酰胺結(jié)構(gòu)類似的共四大類10種低分子量胺類化合物做了PCR反應(yīng)添加實驗。實驗結(jié)果表明，acetamide對中等GC含量的片段擴增有非常好的效果，而對高GC含量的片段卻并不是這樣；2-pyrolidone對多數(shù)基因片段都有特別好的增強擴增的效果，特別是在高GC含量的擴增中表現(xiàn)出很好的效果。DMSO是也是一種較早被發(fā)現(xiàn)的且廣泛應(yīng)用的PCR增效劑。P.R.Winship5、B.Bachmann32等較早對DMSO在PCR產(chǎn)物測序中能有效降低DNA鏈的復(fù)性做過報道，隨后D. Pomp33，G. Sarkar8

9、, Filichkin.S.A.34及Sun Y35等人對DMSO在PCR中的應(yīng)用做了進一步的研究，雖然他們的報道中都指出DMSO能夠全部或部分的提高PCR反應(yīng)的特異性，但各自報道的有效作用濃度都有很大差別，添加量從0.9到15不等，過高濃度的DMSO均能抑制PCR反應(yīng)。肖志壯36等人就過量DMSO抑制PCR反應(yīng)及降低PCR擴增的特異性的現(xiàn)象在所實驗的PCR模型上做過專門的研究并提出了應(yīng)對的策略，他們的研究表明，在10 %DMSO 的反應(yīng)體系中，引物濃度為7. 5 ×10 - 7mol/ L 時，模板濃度提高到1. 6×10 - 10mol/ L即可完全避免非特異擴增。值得

10、注意的是，10 %DMSO存在時，如果引物濃度降低至7. 5 ×10 - 8mol/ L，則看不到特異產(chǎn)物，也就是說，反應(yīng)體系含DMSO時，需增加引物濃度，保證PCR特異擴增。因此，DMSO用于PCR時一定要注意平衡模板、引物及DMSO的濃度，這一點值得我們在應(yīng)用DMSO的PCR實驗中加以注意。鑒于DMSO在優(yōu)化PCR反應(yīng)中所起的效果且同樣為了開發(fā)新的更高效的PCR添加劑，Raj Charabarti等人37還對其它幾種水溶性亞砜類化合物在PCR中的應(yīng)用做了相應(yīng)的研究，以期判斷它們是否也具有同樣的優(yōu)化PCR反應(yīng)的效果。在實驗中，他們選用了三種高GC模板PCR模型，就DMSO、meth

11、yl sec-butyl sulfoxide, n-propyl sulfoxide, n-butyl sulfoxide, and tetramethylene sulfoxide 等五種亞砜類化合物優(yōu)化PCR反應(yīng)的分別做了測試。在這五種測試的亞砜類化合物中，methyl sec-butyl sulfoxide為唯一一種分子結(jié)構(gòu)呈不對稱性的化合物，tetramethylene sulfoxide為唯一一種分子結(jié)構(gòu)含環(huán)形功能團的化合物。在三種高GC模板模型中，牛腦GTP cDNA（660bp, 58%GC）模板為主要受測模型，所有五種亞砜類化合物首先在這個模型上進行測試。結(jié)果表明，除添加n-b

12、utyl sulfoxide的實驗組未出現(xiàn)任何目的產(chǎn)物外，其它四種被測化合物均有表現(xiàn)出很強的提高PCR反應(yīng)特異性的效果，且對應(yīng)得到目的產(chǎn)物均有很高的產(chǎn)量。具體效果效果為：tetramethylene sulfoxide為效果最佳，methyl sec-butyl sulfoxide次之，接下來是n-propyl sulfoxide，DMSO以其只能獲得所有產(chǎn)物中89的特異性產(chǎn)物而居最后。在產(chǎn)量上，添加tetramethylene sulfoxide，methyl sec-butyl sulfoxide及n-propyl sulfoxide后的實驗組為添加DMSO實驗組的23倍多。而在接下的來實

13、驗中，對剩下四種化合物，同樣以牛腦GTP cDNA（660bp, 58%GC）模板為模型實驗了的各種化合物的有效作用濃度范圍，實驗結(jié)果表明，tetramethylene sulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.281.0M，methyl sec-butyl sulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.030.31M，n-propyl sulfoxide的有效作用濃度范圍為：0.150.36M，DMSO的有效作用濃度范圍為：0.751.25M。在996bp人骨髓白細胞c-jun cDNA ( 64%GC)模型上所做的進一步測試表明，變性溫度為95時，tetramethylene sulfox

14、ide相比于DMSO有較好的作用效果，而propyl sulfoxide相比于DMSO則效果較差；變性溫度為92時，tetramethylene sulfoxide則為唯一有效的添加劑。而在511bp人PSM cDNA(52%GC, 158bp 73% GC 片段)模型上的測試再一次證明tetramethylene sulfoxide為最有效的添加劑，DMSO次之，propyl sulfoxide居最后。和作者稍早前基于相同的出發(fā)點對系列砜類化合物作為PCR添加劑所做研究的結(jié)果對比分析可知38，雖然methyl sulfone比DMSO的效果稍好，但亞砜類化合物總體來說作用效果要好于砜類化合物

15、。作者進一步的比較分析指出，這種在PCR反應(yīng)中不同亞砜類化合物間所表現(xiàn)出的不同效果是有一定的化學式上的結(jié)構(gòu)依賴性的，同比來說環(huán)狀結(jié)構(gòu)的砜類、亞砜類及胺類化合物作用效果明顯優(yōu)于其它結(jié)構(gòu)的化合物。有研究者認為DMSO提高PCR反應(yīng)的特異性是由于其于模板DNA的大溝和小溝結(jié)合并破壞其雙鏈結(jié)構(gòu)，在這里，作者認為環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物的獨特作用效果可能是由于其破壞了模板DNA大溝和小溝里帶有供體和受體互補氫鍵的理想構(gòu)象，也有可能其通過限制DNA鏈的自由旋轉(zhuǎn)而使得DNA骨架的相鄰基團間位間排斥減小。新型高效是以上從結(jié)構(gòu)類似化合物中篩選新PCR添加劑的出發(fā)點，近年來，復(fù)合型PCR添加劑的開發(fā)更是朝這各目標又邁進了一

16、步。所謂的復(fù)合型添加劑就是把兩種或兩種以上的PCR添加劑通過一定的比例混合在一起形成的新型PCR添加劑，和單一PCR添加劑相比，其促進PCR的效率更高。N. Baskaran 等人39的報道中，實驗了四種不同的片段的PCR，其中兩個高GC片段（64和80），兩個非高GC片段（44和52）。當在同一個體系中同時擴增四個片段時，實驗表明1.0M的甜菜堿結(jié)合68DMSO及5DMSO結(jié)合1.21.8M的甜菜堿能很好的同時擴增出四種目的片段，雖然高濃度的DMSO及高濃度的甜菜堿在也能擴增出某種或某幾種片段，但四種目的片段的產(chǎn)量均衡性比不上甜菜堿和DMSO組成的復(fù)合型添加劑。最近，J. Kang等人7在隨

17、機序列DNA文庫的同步PCR擴增試驗中也同樣發(fā)現(xiàn)1M的甜菜堿結(jié)合5DMSO能改善PCR擴增的效果。相比于以上兩種PCR添加劑組成的簡單復(fù)合型添加劑，M. Ralser等人40及M. Musso等人41則相繼報道了三種以上PCR添加劑組成的復(fù)合型添加劑。Markus Ralser等人對其混合配置形成的含有甜菜堿，DMSO，DTT及BSA四種物質(zhì)的復(fù)合型添加劑在12對引物(GC含量6175)擴增實驗中進行了測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳的復(fù)合型添加劑配比如下（30ul體系中終濃度）：0.54M甜菜堿、1.34MDTT、1.34DMSO及11ug/mlBSA。在這一最佳配比下可以獲得最好的PCR擴增特異性和最高

18、的PCR擴增產(chǎn)量。他們的實驗結(jié)果還表明，這種配比的PCR增效劑同比于Qiagen，Invitrogen及Bioline等品牌的商品化PCR增效劑在PCR增效效果上是相當，而且和各種不同的DNA聚合酶及各種不同的模板均具有很好的兼容性。稍后，M. Musso等人應(yīng)用1.3M甜菜堿，50uM 7-deaza-dGTP及5DMSO混合而成的復(fù)合型添加劑高產(chǎn)量擴增了GC含量為79的長度為392bp的DNA片段，接下來在另外兩段DNA片段（GC含量為67.8和72.7）的擴增中這種復(fù)合型PCR添加劑同樣能幫助獲得高特異性的擴增產(chǎn)物。近年來，和復(fù)合型PCR添加劑一樣，新化合物及新材料PCR添加劑的研究開發(fā)

19、是PCR添加劑研究的新方向。海藻糖、homoectoine、Zn2+1,7-bis(4-quinolylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Zn2+Q2-cyclen)、單壁碳納米管（SWNTs）及納米金膠體等數(shù)種新PCR添加劑被人們研究和發(fā)現(xiàn)。這其中，納米材料的應(yīng)用具有重要的意義，它開辟了PCR添加劑研究的新天地。海藻糖是一種一種非還原性二糖，是由兩個分子的D-葡萄糖單元通過,-1,1糖苷鍵連接而成。和甜菜堿的效果類似，它能夠幫助有機體抵抗干燥，脫水，熱，冷和氧化等外在因素的干擾。海藻糖最早見于cDNA合成反應(yīng)中的應(yīng)用，在反應(yīng)中其能顯著的提高酶的熱

20、穩(wěn)定性42。A. N. Spiess等43報道過其在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用，他們的研究指出海藻糖能很好的促進高GC含量片段的擴增。在由Real-Time PCR儀器軟件所給出的曲線圖上，清楚的顯示出在一定的濃度范圍內(nèi)隨著海藻糖濃度的增加PCR反應(yīng)效率也不斷增加。僅當海藻糖的濃度大于0.6M時PCR的反應(yīng)效率才有所下降。為了說明海藻糖對Taq酶的熱穩(wěn)定性的影響，在Taq酶進入PCR反應(yīng)前，他們在95下對含有0.2M的海藻糖及不含海藻糖的Taq酶進行了30分鐘和90分鐘的保溫實驗。保溫是在標準的PCR反應(yīng)的Buffer中進行的，這樣可以保證和真實PCR反應(yīng)的環(huán)境相一致。在接下來的實驗中，用這種保溫后的

21、Taq酶進行PCR擴增。結(jié)果顯示，添加海藻糖的Taq酶在保溫30分鐘后同比于未添加海藻糖的Taq酶其熱穩(wěn)定性只有微弱的增加，但是在保溫90分鐘后同比卻有很大的增加。在文中，作者還比較了海藻糖和甜菜堿的效果，結(jié)果表明一定濃度的甜菜堿雖然具有和海藻糖相似的增加PCR反應(yīng)效率的效果，但海藻糖的有效作用濃度范圍比甜菜堿要大，這就說明海藻糖在應(yīng)用上比甜菜堿會更方便。Homoectoine是一種由L-ectoine衍生合成而得到的一種新化合物M. Schnoor等人44在比較了Betain(甜菜堿)，-hydroxyectoine，L-ectoine及homoectoine等四種化合物后發(fā)現(xiàn)homoect

22、oine降低DNA Tm值的效果是所有四種物質(zhì)中最強的。在隨后的PCR反應(yīng)添加實驗中，他們發(fā)現(xiàn)相比于甜菜堿更低濃度的homoectoine就能達到和甜菜堿相似的特異性擴增效果。Zn2+cyclen（cyclen= 1,4,7,10-tetraazacyclododecane）是一種大環(huán)四胺鋅復(fù)合物，有研究發(fā)現(xiàn)，當溶液中解離常數(shù)為0.3mM、pH為8.0時能選擇性的和dT結(jié)合45。因而當大環(huán)四胺鋅復(fù)合物與雙鏈DNA結(jié)合時，其與dT的選擇性結(jié)合可以削弱A-T堿基對間的氫鍵，從而引起了DNA的Tm值的下降。Zn2+Q2-cyclen是Zn2+cyclen的衍生物，E.Kituta等人46發(fā)現(xiàn)由于其在

23、喹啉環(huán)和nucleobase之間多出了兩個-鍵的堆積作用，從而和dT的結(jié)合比Zn2+cyclen要更緊密（Kd10uM，pH8.0）。他們小組的E. Kinoshita等人47在后來的進一步研究中發(fā)現(xiàn)，對于完全配對的短寡核苷酸雙鏈（homoduplex）和不完全配對（一個堿基錯配）的寡核苷酸雙鏈（heteroduplex），Zn2+Q2-cyclen降低heteroduplex的Tm值能力更強，數(shù)據(jù)顯示在Zn2+Q2-cyclen濃度超過5uM時heteroduplex的Tm變得幾乎很難測量到。文中的數(shù)據(jù)還顯示，這種獨特的降低Tm值的現(xiàn)象在其它幾種常見的具有降低Tm值特性的PCR添加劑中卻沒有

24、觀察到。這個結(jié)果提示我們，Zn2+Q2-cyclen具有防止引物錯配的明顯優(yōu)點，因此也就可以用來在低效PCR的擴增中提高特異性。他們就這個問題在同一篇報道中做了相應(yīng)的研究，結(jié)果表明以基因組DNA及cDNA文庫為模板進行的PCR擴增中均能看到Zn2+Q2-cyclen提高PCR特異性的效果，而最佳的Zn2+Q2-cyclen添加濃度是和體系中的模板DNA及引物的量是相關(guān)的。碳納米管（CNTs）又稱納米碳管，是一種新型的納米材料，它是由日本科學家于1991年首先發(fā)現(xiàn)48。按其壁包含碳原子層的多少可以分為單壁碳管（SWNTs），雙壁碳管（DWNTs）及多壁碳管（MWNTs）。CNTs的直徑為幾個納米

25、到幾十個納米不等。碳納米管的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，具有巨大的商業(yè)價值：其高強度的特性使它可以作為超細高強度纖維，也可作為復(fù)合增強材料；其獨特的電學性能，使其可用于多種半導(dǎo)體器件，如場效應(yīng)晶體管、二極管、邏輯電路等，甚至大規(guī)模集成電路49。在生物技術(shù)領(lǐng)域，碳納米管可作為納米藥物載體，亦可見作為納米生物傳感器得到應(yīng)用50,51。迄今為止，碳納米管做為添加劑在PCR中的應(yīng)用僅見一篇文獻報道。D. Cui等人52的對SWNTs做為PCR添加劑的研究表明，在濃度低于3g/ul時隨SWNTs濃度的增加PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量逐漸提高，但當濃度大于3g/ul時產(chǎn)量卻受到抑制。PCR體系不含Mg2+時也同樣觀察到相似的結(jié)

26、果。膠體金做為PCR添加劑，由上海交通大學H. Li等人15首先發(fā)現(xiàn)并在Angew. Chem. Int. Ed.上進行了報道，他們發(fā)現(xiàn)直徑為10nm的納米金顆粒在一定濃度范圍內(nèi)能顯著提高PCR反應(yīng)的特異性。結(jié)果顯示在添加金納米顆粒后，電泳圖上與目的片段DNA相對應(yīng)的地方僅出現(xiàn)一條顯著性的條帶，而未添加金納米顆粒的電泳圖上則顯示明顯的拖尾現(xiàn)象。在進一步對濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8及1.0nM的納米顆粒添加后所得產(chǎn)物的電泳圖進行比較后得出，從0.2nM依次到0.8nM，PCR反應(yīng)的特異性逐漸提高，但當反應(yīng)體系中存在過多的金納米顆粒（1.0nM）時，PCR反應(yīng)會被有力地抑制，產(chǎn)物的量

27、明顯降低。他們還對比研究了分別在25，30，35，40下退火時添加金納米顆粒前后產(chǎn)物的電泳圖，結(jié)果顯示，同一溫度下，金納米顆粒添加前后圖譜中條帶形成了鮮明地對比，即使在25的較低溫度下退火，添加金納米顆粒后都顯示出了非常好的特異性。之后不久，與Haikuo Li等人發(fā)現(xiàn)膠體金顯著提高PCR特異性不同，臺灣的研究人員Min Li等人16則發(fā)現(xiàn)膠體金具有提高PCR反應(yīng)靈敏度的特性。他們在研究中發(fā)現(xiàn)，在保證相同或更高的擴增產(chǎn)量的情況下，添加直徑為7nm13nm的納米金顆?？梢允筆CR反應(yīng)的時間縮短。通過不同的PCR系統(tǒng)、不同的DNA聚合酶及不同的模DNA的PCR添加實驗后發(fā)現(xiàn)，對于慢速PCR儀通過添

28、加納米金顆?？梢蕴岣逷CR靈敏度510倍，而在快速PCR儀上這一數(shù)值可以提高到104。從以上的報道可以知道，納米材料做為新型的PCR增效劑不僅可以增加PCR特異性和效率，而且可以提高PCR反應(yīng)的靈敏度。這是迄今為止其它類型的PCR所無法比擬的。非離子性洗滌劑，例如0.1-1% 的Triton X-100, Tween 20 或是NP-40，通?？梢越档虳NA二級結(jié)構(gòu)。雖然這樣可以增加模板基因的擴增，但也會帶來非特異性擴增的困擾。所以，這些添加劑對無雜物低產(chǎn)量的PCR反應(yīng)很管用，但對相對不太純的PRC反應(yīng)就沒那么好了。非離子性洗滌劑的另外一個好處就是可以減少SDS 污染。通常在DNA提取過程中，SDS會被帶到PCR這個步