不同工藝條件下肽-紫杉醇包埋體制備時肽對紫杉醇載藥量的影響

1、不同工藝條件下肽紫杉醇包埋體制備時肽對紫杉醇載藥量的影響阮麗萍，陳會（四川大學化學工程學院，成都，610065）摘要：論文以新型設計短肽ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-phe-glu-pro-nh?為載體材料研究 了肽紫杉醇的包埋體的制備。在包埋體制備過程中使用溶劑揮發(fā)法，采取單因索分析法研 究了溫度、混合方式、溶劑以及濃度各因素對其包載率的影響。不同實驗條件下紫杉醇的包 載率通過高效液相法測定得到。研究表明，使用甲醇作為紫杉醇的溶劑，肽濃度為4mg/ml, 35°c下超聲混合加料的方式制備得到的肽紫杉醇的包埋體具有較好的包埋率。關鍵詞：肽；白組裝；紫杉醇；包埋

2、；高效液相色譜法中圖分類號：tb34the effect of different preparation technology to thedrug-loading rate of paclitaxel in peptide-paclitaxelcomplexesruan liping, chen hui（college of chemical engineering, sichuan university, chengdu, 610065）abstract: tn this work, a novel designed peptide ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-

3、phe-glu-pro-nh? was studied as a carrier for paclitaxel. the peptide-paclitaxel complexes were parepared through solvent volatilization using different temperatures, mixture methods, solvents and concentrations the durg-loading rate of different experiments were detected by hplc the results indicate

4、d that the peptide-paclitaxel complex had better durg-loading rate, which parepared at 35°c, using methyl alcohol as solvent, mixed the peptide （4mg/ml） and paclitaxel by sonication.key words: peptide; self-assembly; paclitaxel; embedding; hplc0引言紫杉醇是一種新型抗微管藥物，主要用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、淋巴瘤、腦瘤也有一定的療效。

5、由于紫杉醇水溶件極差，日前市售的紫杉醇制劑多由聚氧乙烯龍麻汕 與無水乙醇以1： 1的比例為溶媒組成，使用時，經5-20倍生理鹽水和右旋糖酊溶液稀釋后 靜脈滴注2。這類劑型可能引起嚴重的過墩反應,神經毒性，心血管毒性，胃腸道反應等 副作用。盡管這些毒副作用可以通過預用藥加以緩解，但整個用藥過程十分不便，嚴重制約 了紫杉醇在臨床上的應用，因此研制無毒性的紫杉醇藥物制劑來代替?zhèn)鹘y(tǒng)劑型應運而牛卩句。阮等設計的兩親性新型肽材料已被證實具有廣泛的潛在應川價備6®,如川于藥物包埋及控釋（.042j,大鼠肝臟快速止血等。兩親性設計肽作為藥物包埋體的研究，主要基于一方而設計的多肽町能通過單體的兩親性特

6、點與藥物作用、包埋實現(xiàn)対藥物分了的增溶，另一方面 由于多肽在體內降解后為氨基酸，可以為人體吸收，無免疫原性等。我們也是基礎這些特點， 探索設計肽成為紫杉醇載體材料的可能。在前期的研究屮我們已經證實了紫杉醇能夠通過氫基金項目:教育部博士點基金項目（編號:20100181120077）；自然科學基金項目（編號:51003065）作者簡介：阮麗萍（1980-）,女，副教授，主要研究方向：納米功能材料的研'r. e-mail: ruanliping 鍵和范徳華力與兩親性肽材料發(fā)生相互作用，從而影響設計肽的自組裝過程。本論文選 擇設計肽序列 ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-

7、phe-glu-pro-nh2 （簡稱 r34）作為代表，該設 計肽具有兩親性特性，并且可以在水溶液中自組裝形成纖維結構。論文通過溫度、加料順序、 溶劑及濃度等包埋體制備工藝的研究，探討了半程匹配電荷短肽r34作為紫杉醇載體材料 的包載率的影響。1實驗部分1.1材料和儀器半程電荷匹配短肽 ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-phe-glu-pro-nh2 （簡稱 r34）采用 fomc 固相肽方法由川抗派德公司（chengdu cp.biochem co.,ltd）代為合成，n端和c端分別采用 乙?；王０坊Ｗo。短肽r34配成lomg/ml儲備液，儲存于4°c冰箱

8、屮備用。紫杉醉由國 家-藥監(jiān)局提供，其純度經高效液和分析大于等于98%,實驗用水均為二次蒸飾水，試劑均 為分析純。實驗中涉及的儀器冇：高效液相色譜儀（agilent technologies 1200 scricsjp）, 78-1型 磁力加熱攪拌器（國華），df-10is集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司） kh5200e型超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司）1.2載藥量測定方法本實驗采川hplc法進行包埋體中紫杉醉的含雖測定。色譜條件如下：diamonsilcl8（200 nm><4.6 mm ,5 gm）；流動相為甲醇:水=35； 35； 30；流速:1.

9、0ml/min；柱 溫:30 °c；檢測波長:227 nine以紫杉醇標準品，用乙膳甲醇蒸鐳水（35： 35： 30, v： v： v）為溶劑作標準曲線，得標準曲線方程，來計算各方法的載藥量。具體為：紫杉醇在包埋體 中的量用高效液相色譜在227 nm條件f,根據(jù)線性方程得到的。先將制備好的己揮發(fā)完有 機溶劑的包埋體溶液用少量去離子水多次洗滌，并全部定量轉移至2ml量瓶中，用去離子 水定容，用0.22 gm微孔濾膜過濾后，進樣測量，再由標準1川線計算其濃度。其屮包封率= 包埋在r34屮的質量/投藥5x100%,在木實驗中市于紫杉醇過量，意義不大。而載藥量二 包埋在r34 '|&

10、#39; ptx的質量/包埋體總質量xl00%o1.3制備條件1.3.1溫度的影響采用恒溫磁力攪拌的方法進行實驗。稱取一定量ptx,用80%甲醇使其溶解得1.5 mg/ml ptx溶液，移取已制備好的10mg/ml肽r34儲備液，用去離子水稀釋至1.5mg/ml。 精密量取ptx溶液和r34溶液各1 ml,置于5 ml血清瓶中，加入磁力攪拌子，恒溫（20°c, 35°c, 50°c）攪拌4h,在30 °c旋轉蒸發(fā)，除去甲醇后將剩余物質用少量去離子水轉移并定 容至2ml量瓶中。取適量用0.22pm微孔濾牘過濾后，進樣測試，再由標準曲線計算其濃度。1.3.2

11、加料方式的影響研究了不同混合方式対載藥量的影響。在實驗詢30 min階段采用不同的物料混合方式， 分別為：超聲，用油相往水相滴加，油相與水相直接混合放入攪拌子攪拌三種方式，其余實 驗條件一致，即接下來加入攪拌子同等條件下攪拌三個半小時，然后在30 °c旋轉蒸發(fā)，除 去甲醉后將剩余物質用少量去離了水轉移并定容至2ml量瓶中。取適量用0.22 pm微孔濾 膜過濾后，進樣測量，再由標準曲線計算其濃度。1.3.3溶劑的影響研究了不同溶劑對r34對ptx的載藥量的影響，分別為80%甲醇和80 %乙醇以及4() %乙jj青為溶劑溶解ptx,在室溫下三組同時進行，其余實驗步驟參考1.3.1。1.3

12、.4濃度的影響研究了不同肽濃度對ptx的載藥量的影響。實驗采川常溫下，80 %甲醇為溶媒并按照1.3.1步驟，考察質量濃度分別為0.8、2.5、4mg/ml的肽r34對ptx的增溶作用，以此來 判斷濃度對制備的影響。2實驗結果2.1溫度的影響本部分考察了各個溫度(20 °c、35 °c以及50 °c)條件下肽r34對紫杉醇的包埋效果。由于多肽在溫度過高時易變性，因此我們選用的實驗最高溫度為50 "co溫度對肽對ptx 的包載率的影響列于表1中。從表1可以看出，多肽對紫杉醇具有明顯的増溶效果，相較丁 ptx 口身的溶解度，肽的加入將其在水溶液屮的溶解度提高

13、3-5倍。并且隨著溫度從20 °c 升高到35 °c,多肽的包載率明顯増大。但當溫度繼續(xù)升高到50 °c時，包載率卻有所下降。 這可能是因為當溫度升高時，溶液中分子的熱運動增強，ptx分子與r34分子接觸機會增 加，較劇烈的分了熱運動為r34提供能量，更有利于r34替換原木形成的ptx甲醇分子屮 的甲醇分子，形成r34-ptx復合物，從而提升了 r34對ptx的增溶效果。當溫度進一步 提升至5() °c時，由前期的實驗研究可知肽r34 口組裝能力下降，這可能是影響r34對ptx 包載能力的直接原因，從而最終導致了包載率的下降。表1溫度對包載率的影響tab

14、le 1 the inlluence of temperature on the package loading rate反應溫度紫杉醇濃度(pg/ml)包載率020 °c0.75761.0135°c134011.78750°c0.942421.2562.2加料方式的影響研究了制備過程屮加料方式對包載率的影響，實驗采用了微乳制備方法，具體的制備 研究分逐滴滴加，超聲以及直接混合攪拌三種方式。不同的加入方式對ptx包載率的影響 見表2o從表2中我們可以看出，超聲的制備效果最好，包載率達1.756 %0。這可能是因為 超聲促進了兩和間的傳質過程，冇利于紫杉醉更好的進入

15、水和與肽r34作用，從而實現(xiàn)包 埋。盡管在很多制備微乳過程比直接混合更有效，但是在木研究中逐滴滴加的制備方法沒有 玄接混合攪拌法包載效果好，這可能是由于滴加過程較慢，期間卬醇的揮發(fā)使得紫杉醇分子 與水體系中的r34分子相互作用的兒率降低，從而導致了包載率的降低。表2加料方式對包載率的影響tabic 2 the influence of preparation methods on the package loading rate加料方式紫杉醇濃度(pg/rnl)包載率0超聲1.317021.756滴加0.506980.676混合0.734750.982.3 溶劑的影響實驗考察了 r34 (室溫

16、，r34濃度為1.5mg/ml)對不同溶劑體系下(甲醇、乙醇以及乙 月青)的紫杉i惇溶液的包埋效果，包載率如表3所示。從表中可以看到，肽r34對溶于甲醇 的ptx溶液的包載率為0.98 %o要遠遠高于其在乙醇溶液和乙脯溶液屮，這應該與溶劑木身 性質有關，r34應該更容易從屮醉的ptx溶液中逍換;il ptx分子來形成r34-ptx作川體。 因此在以后的肽包載研究中宜釆用甲醇作為ptx的溶劑。表3溶劑對包載率的彩響table 3 the influence of solvent on the package loading rate反應條件紫杉醇濃度(pg/ml)包載率0甲醇0.734750.9

17、8乙醇0.523570.069乙睛0.45690.062.4濃度的影響實驗研究了不同肽濃度(0.6, 1.5, 4.0 mg/ml)對ptx的包載效果的彩響，結果見表4o實驗中采用甲醇作為ptx的溶劑。從表屮可以看到，隨著r34濃度的增加，肽對紫杉醇 的包載率明顯增大。這也許是因為當濃度很低時，肽白紐裝形成的纖維比較少，參與包埋的 紫杉醉顆粒也相當較少。當r34濃度增人時，肽口組裝能力也顯著增加，并能更好地將紫 杉醇包埋起來，而且濃度為4 mg/ml時，肽對紫杉醇的包載率達到了 6.771 %。,說明增加濃 度冇利丁肽對紫杉醉的包埋。表4濃度對包載率的影響table 4 the influen

18、ce of concentration on the package loading rate反應條件紫杉醇濃度(pg/ml)包載率。濃度0.6 mg/nil0.54070.721濃度 1.5 mg/ml0.734750.98濃度4.0 mg/ml5.078116.7713討論由于紫杉醇的難溶性，我們采川了常川的溶劑揮發(fā)法，通過包載率的測定來評價各種 制備方法。首先考慮到溶劑的影響，為了盡可能地避免破壞多肽的生物活性，我們使用了甲 醇、乙醇、乙睹等常見的溶劑，由于甲醇與乙醇小含有oh基i才i,在體系中容易與多肽形成 氫鍵，因而多肽比在乙膳中更容易進入含紫杉醉的冇機體系，這可能是乙席包載率低的原

19、因。 與甲醇相比，乙醇分子更易形成氮鍵，在約物以及乙醇與多肽發(fā)牛相互作川時，產生競爭作 用，并冃乙醇對于多肽的二級結構有一定的影響，可能直接導致了其相對于甲醇，包載率要 差些。涉及到溫度時，當然在35°c時最好，這不僅符合動力學規(guī)律，也止好說明了其牛物 活性，溫度過低或過高都不利丁蛋口質多肽的止?；钚缘陌l(fā)揮。對丁制備方式的影響，首先 是混合的程度，山于滴加過程伴隨著揮發(fā)，所以其混合程度顯然不如直接攪拌，但攪拌的力 度顯然沒有超聲強，超聲的攪拌湍動作川顯然有助于多肽対紫杉醇的包埋。對于肽濃度対紫 杉醇包載率影響可以看到，由于紫杉醇的疏水性，其在水中的溶解度的增加完全借助于多肽 的分散及

20、包埋，當肽濃度越高，其包裹能力就越強，包載率也就越高。此外，cd圖顯示紫 杉醇的加入對多肽的二級結構冇一定的影響，但影響不大。4結論論文以半程電荷匹配短肽r34為載體材料制備了紫杉醇的包埋體，通過窩效液相法測 足了紫杉酹包載率。在包埋體制備過程中采用了溶劑揮發(fā)法，采取單因素分析法研究了溫度、 混合方式、溶劑以及濃度各因素對其包載率的影響。研究表明，在本研究中，使用甲醇作為 紫杉醇的溶劑，肽濃度為4 mg/ml, 35°c下超聲混合加料的方式制備得到的肽-紫杉醇的包 埋體具有較好的包埋率。參考文獻1 pandita d, ahuja a and lather v，et al. deve

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