控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查操作規(guī)程

1、1目的建立一個控制菌檢查用培養(yǎng)基檢查操作程序0文件批準表職責部門及職責姓名簽名日期起草部相關(guān)部門審核qa審核質(zhì)量管理部部門審核部批準質(zhì)量負責人文件復審日期2適用范圍控制菌檢查中用的培養(yǎng)基。檢查項目包括培養(yǎng)基的促牛長、指示和抑制特性能力。3發(fā)放范圍質(zhì)量部4職責責任人職責質(zhì)量部負責起草執(zhí)行該文件。5內(nèi)容5. 1菌種和菌液制備5. 1. 1控制菌檢查用培養(yǎng)適用性檢查試驗用菌株。大腸埃希菌(escherichia coli) cmcc(bo 44102金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus) cmcc (bo 26003乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌(pseudomonas aeru

2、ginosa) cmcc(b) 10104牛梭菌(clostridium sporgenes) cmcc (b) 64941白色念珠菌 candida albicans) cmcc(b) 980015.1.2將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆豚 液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基上，30-35°c培養(yǎng)18-24小時，將白色念珠菌 接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20-25°c培養(yǎng)2-3天，將生抱梭菌接捉于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下30-35°c培養(yǎng)24-48小時或接種于硫乙 醇酸鹽液體培養(yǎng)基中30-35

3、°c培養(yǎng)18-24小時。5. 2各種培養(yǎng)基需要測試的能力及判斷指標5.2.1液體培養(yǎng)基促生長能力檢查，取不大于loocfu的試驗菌分別接種于被檢查培養(yǎng) 基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下 培養(yǎng)。增菌培養(yǎng)基多澄清液體培養(yǎng)基，與對照培養(yǎng)基比較，被檢查培養(yǎng)基中試驗菌應生 長良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基渾濁。固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：取試驗菌液（含菌數(shù)不大于loocfu）分別涂布于被檢查 培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短時間下 培養(yǎng)，與對照培養(yǎng)基比較，被檢查培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應 一致。若被檢查

4、培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落數(shù)的比值應在50-200%, 且菌落形態(tài)、大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，則判斷該培養(yǎng)基的適用性檢查促生長 能力符合規(guī)定。5. 2.2培養(yǎng)基抑制能力檢查：取不少于loocfu的試驗菌分別接種于被檢查培養(yǎng)基和對 照培養(yǎng)基，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不不小于規(guī)定的最長培養(yǎng)基時間下培 養(yǎng)，試驗菌應不得生長。5.2.3液體培養(yǎng)基指示能力檢查：取不大于loocfu的試驗菌分別接種于被檢培養(yǎng)基和 對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培 養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基比較，被檢查培養(yǎng)基中試驗菌應生長情況/指示劑反應等應與對照培 養(yǎng)基一致。固體

5、培養(yǎng)基指示能力檢查：取試驗菌液（含菌數(shù)不大于loocfu）分別涂布于被檢查培 養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，在和應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的時間下培養(yǎng)， 與對照培養(yǎng)基比較，被檢查培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征、菌落顏 色及指示劑反應等應一致。5. 3控制菌檢查用培養(yǎng)基能力測試列表控制菌檢查涉及的14種培養(yǎng)基特點各異味，表中概述培養(yǎng)基檢查的具體項冃，具體操 作在其后說明。表1控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力和指示特征控制菌的檢查培養(yǎng)基特征試驗菌株耐明鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養(yǎng)基促生長能力人腸埃希菌、銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+

6、指示特征大腸埃希菌、銅綠假單胞菌大腸埃希菌麥凱康液體培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥凱康瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特征大腸埃希菌rv沙門菌增菌液體培養(yǎng) 基促生長能力乙型副傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性乙型副傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基指水能力乙型副傷寒沙門菌漠化十六烷基三甲鞍瓊脂培養(yǎng)基促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力大腸埃希菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力生砲梭菌哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基促生長能力生抱梭菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生

7、長能力+指示特性白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大腸埃希菌5. 4控制菌培養(yǎng)基適用性檢查的具體操作過程：5.4. 6木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基：新鮮配制對照木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，121°c滅菌15分鐘，備用。取含沙門菌的rv沙門增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上30-35°c培養(yǎng)18-48小時，被檢培養(yǎng)基同法操作。 培養(yǎng)18小時，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致， 培養(yǎng)48小時，空白平板和接種金黃色葡萄球菌的平板應不得生長。5. 4.7三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基新鮮配制對照三糖鐵瓊脂培

8、養(yǎng)基，121°c滅菌15分鐘，制成 高底層（2-3cm）短斜面，備用，用接種針挑取在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平 板上生長的疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng) 18-24小時，被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18小時，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及 顏色與對照培養(yǎng)基上的菌落一致;培養(yǎng)24小吋，空白平板應無菌落生長。5.4.8漠化十六烷基三甲鞍瓊脂培養(yǎng)基 新鮮配制對照漠化十六烷基三甲鞍瓊脂培養(yǎng) 基，121°c滅菌15分鐘，備用。冷卻至60°c傾注平皿，35°c培養(yǎng)箱預培養(yǎng)8小時后備 用。取7個無菌瓊脂平板，分別涂布接種銅綠假單胞菌

9、和大腸埃希菌各3皿，接種菌 液0. 1ml （含菌50-100cfu）,另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規(guī)定溫 度30-35°c倒置培養(yǎng)18-72小時，被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18小時，被檢培養(yǎng)基菌 落大小、形態(tài)特征及顏色應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，培養(yǎng)72小時，空白平板和接 種大腸埃希菌的平板應無菌落牛長。5.4.9廿露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 新鮮配制對照廿露醇氯化鈉瓊脂培基，121°c滅菌15 分鐘，冷卻至60°c冷卻至60°c傾注平皿，35°c培養(yǎng)箱預培養(yǎng)8小時后備用。取5個無 菌瓊脂平板，分別涂布接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各2

10、皿，接種菌液0. lnil （含 菌50-100cfu）,另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規(guī)定溫度30-35°c倒 置培養(yǎng)18-72小時，被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18小時，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài) 特征及顏色應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，培養(yǎng)72小吋，空白平板和接種大腸埃希菌 的平板應無菌落生長。5. 4.10梭菌增菌培養(yǎng)基 新鮮配制對照梭菌增菌培養(yǎng)基2瓶，121°c滅菌15分鐘，備 用，接種生砲梭菌1瓶，接種菌液51 （不大于loocfu）,另一瓶不接種菌株作為空白對 照，置規(guī)定溫度30-35°c厭氧條件下培養(yǎng)48小時，檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)48小時，

11、空白培養(yǎng)瓶應不得渾濁，與對照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗菌應生長良好，表現(xiàn) 為液體培養(yǎng)基變渾濁。5.4. 11哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基 新鮮配制對照哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，121°c滅菌15分鐘, 冷卻至60°c傾注平皿，35°c培養(yǎng)箱預培養(yǎng)8小時后備用。取3個哥倫比亞瓊脂平板， 涂布接種生孑包梭菌各2 1111,接種菌液0. 1ml （含菌50-100cfu）,另一平板不接種菌作 為空白對照，涂布均勻后于規(guī)定溫度30-35°c的厭氧條件倒置培養(yǎng)48-72小時，被檢 培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)48小時，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應與對照培養(yǎng) 基上的菌落一致，培養(yǎng)

12、72小時，空白平板和接種大腸埃希菌的平板應無菌落生長。哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，適宜多數(shù)需氧菌的生長，為了消除其它雜菌生長對 檢查結(jié)果的影響，可在每升滅菌后培養(yǎng)基中按無菌操作添加含有相當于20mg慶大霉素 的硫酸慶大霉素。添加慶大霉素的哥倫比亞瓊脂可參照上述方法進行培養(yǎng)基適用性考 察。5.4. 12沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 新鮮配制對照 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基2瓶，21°c滅菌 15分鐘，備用，接種白色念珠菌1瓶，接種菌液51（不大于loocfu）,另一瓶不接種菌 株作為空白對照，置規(guī)定溫度30-35°c培養(yǎng)3-5天，檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)3天，與 對照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中

13、試驗菌應生長良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁。培養(yǎng)5 天，空白培養(yǎng)瓶和接種大腸埃希菌的培養(yǎng)瓶應不得渾濁。5. 4. 13沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 新鮮配制對照沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，121°c滅菌15 分鐘，冷卻至60°c傾注平皿，35°c培養(yǎng)箱預培養(yǎng)8小時后備用。取3個沙氏葡萄糖瓊 脂平板，涂布接種白色念珠菌各2皿，接種菌液0. 1ml （含 菌50-100cfu）,另一平板 不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規(guī)定溫度30-35°c倒置培養(yǎng)24-48小時，被檢 培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)24小時，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征、顏色及氣味應與對 照培養(yǎng)基上的菌落一致，培養(yǎng)48小時，空白平板和接種大腸埃希菌的平板應無菌落牛 長。5. 4. 14念珠菌顯色培養(yǎng)基新鮮配制對照念珠菌顯色培養(yǎng)基，加熱充分溶解，冷卻至 60°c傾注平皿，35°c培養(yǎng)箱預培養(yǎng)8小時后備用。念珠菌顯色平板使用前避光保存，取 5個無菌念珠菌顯色平板，分別涂布接種白色念珠菌和大腸埃希菌各2皿，接種菌液 0. lml （含菌50-100cfu）,另一平板不接種菌作