考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院：第二臨床醫(yī)學(xué)院 專業(yè):臨床醫(yī)學(xué) 年級(jí)：2013級(jí) 班級(jí)：US姓名： _學(xué)號(hào)：_日期：2014,3,8 得分：實(shí)驗(yàn)課程：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)名稱：蛋白質(zhì)的定量測(cè)定（五）考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)握誇馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含長(zhǎng)的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】考馬斯亮藍(lán)G-250 （C（x）massic G-250）是一種甲基取代的三苯基甲烷，分于中磺酸基的藍(lán)色 染料，在處有黒大吸收值。考馬斯亮藍(lán)G-250能與蛋白質(zhì)通過范得華相互作用形成 蛋白質(zhì)一考馬斯亮藍(lán)復(fù)臺(tái)物藍(lán)色溶液，引起該染料的呈大吸收Xmax的位萱發(fā)生紅移，在 595nm處有是大吸收宣。由于蛋白質(zhì)一考馬斯亮藍(lán)食臺(tái)物在

2、595n處的光吸收遠(yuǎn)高于考馬斯 亮藍(lán)在465nm處的光吸收，因此可大大地提高蛋白質(zhì)的測(cè)定靈敏度。蛋白質(zhì)一誇馬斯亮藍(lán) 復(fù)臺(tái)物溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的'濃度成正比。利用溶液顏色的差異進(jìn)行比色測(cè)定，適臺(tái)于 蛋白質(zhì)類的定是分析尤其適臺(tái)于稀有蛋白質(zhì)的微星分析。考馬斯亮藍(lán)G-250試劑呈色反應(yīng)顏 色穩(wěn)定、靈敏度高，最低測(cè)試蛋白質(zhì)長(zhǎng)在lug左右?！驹噭┡c器材】試劑：誇馬斯亮藍(lán)試劑：誇馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml質(zhì)長(zhǎng)濃度為0.85g/ml 的磷酸，用蒸憎水稀釋到1000mlo標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：結(jié)晶牛血清清蛋白，預(yù)先經(jīng)微長(zhǎng)凱氏定氮法標(biāo)定該蛋白質(zhì)的百分含長(zhǎng)，然 后根據(jù)該蛋白的純度

3、用0.15m（l/LNacl配制成l.Omg/ml蛋白溶液。器材:試管和試管架722型分光光度計(jì)吸長(zhǎng)管移液槍【實(shí)驗(yàn)步驟】一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液/ml00.20.40.60.81.0009%Nxl溶液/ml10.80.60.40.200誇馬斯亮 藍(lán)實(shí)劑/ml一53*535各管混勻后，靜晝3血門，以0號(hào)管為空白管調(diào)零，在595晌 波長(zhǎng)下分別測(cè)定各管溶液的 吸光度值（A595）以A595值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、待測(cè)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定測(cè)定方法同上，1兇待測(cè)蛋白質(zhì)家5兇誇馬斯亮藍(lán)試劑，。用上述0號(hào)管調(diào)零，測(cè)出血清的 人595值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】管號(hào)012345

4、6吸光度值0.1560.1970.2620.2920.3190.3620.119一統(tǒng)性o尺光JStfi)M白鄆農(nóng)!s由儀器測(cè)長(zhǎng)可得A595=0.179,可得標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液為0.0790mg/ml.【注意事項(xiàng)】必須在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。測(cè)定中蛋白-染料龜臺(tái)物會(huì)有少部分吸附在比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將比色杯清洗干 凈?！舅伎寂c討論】一、誇馬斯亮蘭法的突出優(yōu)點(diǎn)是：(0因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)臺(tái)后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)一染料復(fù)臺(tái)物有更高的消光系 數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。(2) 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只雷加一種試劑。完成一

5、個(gè)樣品的測(cè)定，只雲(yún)要5分鐘左右。由于 染料與蛋白質(zhì)結(jié)臺(tái)的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且 在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最 奸。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。(3) 干擾物質(zhì)少。如干擾Swy法的K+、Na+、Mg2+、離于Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘 油、疏墓Z1醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。二、此法的缺點(diǎn)是：(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含長(zhǎng)不同，因此Bradford法用于不同蛋 白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用一球査白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方 面的偏差。(2) 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton 3100、十二烷基 硫酸鈉(SDS)和0N的NaOH (如同0N的酸干擾Lowary法