酶工程實驗07336

1、實驗1、大蒜細(xì)胞sod的提取和分離一、原理超氧化物歧化酶(sod)是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用 酶。它可催化超氧負(fù)離了(o2)進(jìn)行歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫。大蒜蒜瓣 和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的sod,通過組織或細(xì)胞破碎后，可用 ph7.8磷酸緩沖液提取出。由于sod不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。二、材料和試劑1、新鮮蒜瓣2、0.05mol/l 磷酸緩沖液(ph7.8)3、氯仿乙醇混合液：氯仿:無水乙醇=3:54、丙酮：用麗需預(yù)冷至4-10°c5、0.05mol/l 碳酸鹽緩沖液(ph10.2)6、o.lmol/l edta 溶液7、2mmol/l腎上

2、腺素溶液三、步驟1、組織細(xì)胞破碎：稱取5g大蒜蒜瓣，置于研缽中研磨。2、sod的提取：破碎后的組織中加入2-3倍體積的0.05mol/l磷酸緩沖液 (ph7.8),繼續(xù)研磨20min,使sod充分溶解到緩沖液中，然后在5ooorpm下離心15min,取上清液。3、除朵蛋口：上清液加入0.25體積的氯仿乙醇混合液攪拌15min, 5000rpm離 心15min,得到的上清液為粗酶液。4、sod的沉淀分離：粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min, 500()rpm離 心15min,得sod沉淀。將sod沉淀溶于0.05mol/l磷酸緩沖液(ph7.8)中， 于55-60°c熱處理15

3、 min,得到sod酶液。5、sod活力測定將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣，測定各口的sod活力。試劑空白管對照管樣品管碳酸緩沖液5.05.05.0edta溶液0.50.50.5蒸憾水0.50.5-樣品液-0.5混合均勻,在30°c水浴中預(yù)熱5min腎上腺素溶液-0.50.5加入腎上腺素后，繼續(xù)保溫2min,然后立即在480nm處測定光密度。對照管和 樣品管的光密度值分別為a和bo在上述條件下，sod抑制腎上腺素自氧化50%所需的酶量定義為一個酶活 力單位。即：酶活力（單位）=2 （a-b） n/a式屮n樣詁稀釋倍數(shù)；2抑制腎上腺素自氧化50%的換算系數(shù)。6、根據(jù)提取液、粗酶液和

4、酶液的酶活力和體積，計算純化提取率。實驗2、釀酒酵母細(xì)胞固定化一、目的要求了解固定化酶及微生物細(xì)胞固定化的原理及其優(yōu)缺點。掌握制備固定化細(xì)胞屮最基本、最常用的方法。學(xué)會用固定化釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵及酒精的測定方法。二、基本原理固定化酶和固定微生物細(xì)胞的原理是將酶或微生物細(xì)胞利用物理的或化學(xué) 的方法，使酶或細(xì)胞與固體的水不溶性支持物（或稱載體）相結(jié)合，使其既不溶 于水，又能保持酶和微生物的活性。它在固相狀態(tài)作用于底物，貝有離了交換樹 脂那樣的特點，有一定的機械強度，可用攪拌或裝柱形式與底物溶液接觸。由于 酶和微生物細(xì)胞被固定在載體上，使得它們在反應(yīng)結(jié)束后，可反復(fù)使用，也可貯 存較長時間使酶和微生

5、物活性不變。微生物細(xì)胞固定化常用的方法有三大類：1. 吸附法；2.包埋法；3.共價交聯(lián)法三、實驗材料（一）菌種釀酒酵母。（-）培養(yǎng)基1 酒精發(fā)酵培養(yǎng)基yg分裝200 ml培養(yǎng)基于300 ml錐形瓶中,共4瓶,經(jīng)100 pa滅菌備用。（三）主要藥品海藻酸鈉、瓊脂、k-角叉膠、葡萄糖、蛋白質(zhì)、酵母膏、明膠、戌二醛等。四、實驗內(nèi)容（一）酵母種子培養(yǎng)液的制備挑取新鮮斜而菌種一環(huán)，接入裝冇30 ml ypd培養(yǎng)基的錐形瓶屮，30°c振 蕩培養(yǎng)，共接4瓶，培養(yǎng)至對數(shù)期。（二）細(xì)胞的固定化：共價交聯(lián)法吸取10 ml培養(yǎng)到對數(shù)期的酵母菌懸液加入加25 ml2%的明膠液中，混合 均勻，倒入15 cm的

6、無菌平川1中，在05°c凍結(jié)后，切成3x3x3mm3小塊，再 浸入1.5%戊二醛中，室溫下交聯(lián)3h,將顆粒轉(zhuǎn)入300 ml錐形瓶中，用無菌去 離了水洗滌三次，加入yg培養(yǎng)基，置30°c培養(yǎng)72 h后測定酒精含量。（三）結(jié)果觀察1.固定化細(xì)胞的回收與活菌計數(shù)（1）取培養(yǎng)72 h的固定化細(xì)胞，如含酵母的k角叉凝膠包埋珠2粒，放 入5 ml無菌生理鹽水中。培養(yǎng)前的凝膠珠同樣處理。（2）37°c輕振15 min,使膠珠溶解。（3）適當(dāng)稀釋后涂布于ypd瓊脂平板進(jìn)行活菌計數(shù)，觀察酵母菌在包埋塊 中的増殖情況。2酒精發(fā)酵液的蒸纟留及酒精度的測定（1）由于木次實驗發(fā)酵液中所含酒

7、精度較低，因此可用明火直接加熱蒸係 （圖 12-2-2） o（2）取100 ml發(fā)酵液，倒入500 ml圓底燒瓶中,力 100 ml蒸鐳水蒸鐳， 沸騰后改用小火。當(dāng)開始流出液體時，用100 ml容量瓶準(zhǔn)確接收鎘出液l（）（）ml。 倒入100 ml量筒中，用酒精比重計測量其酒精度。剩余的發(fā)酵液全部倒出后棄 去，將固定化細(xì)胞用無菌去離了水洗3次，加入yg培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h,測 酒精含量，可反復(fù)使用數(shù)十次。e 12-2-2固定化細(xì)胞酒精發(fā)酵液蒸憎裝置1發(fā)酵液裝于燒瓶內(nèi)：2冷凝管；？酒精收集器五、實驗報告內(nèi)容（-）將釀酒酵母細(xì)胞固定化經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的結(jié)果填入下表。表12 - 2-1酒箱測定艮活細(xì)購

8、計數(shù)的結(jié)果表菌號載體取樣時間/h酒藉/度活細(xì)胞計數(shù)水/個ml-1水細(xì)胞數(shù)目以k角叉膠為例（二）以海藻酸鈉凝膠制備為例，闡述微生物細(xì)胞包埋法的制作過程。（三）試比較實驗屮所用載休對釀酒酵母產(chǎn)酒精量有何差別？六、思考題微生物細(xì)胞同定化在發(fā)酵工業(yè)上冇何意義？實驗3、親和層析法純化胰蛋口酶一、實驗?zāi)康? 熟悉親和層析純化蛋口質(zhì)的的原理。2初步掌握親和層析法純化朕蛋白酶的方法步驟。二、實驗原理親和層析主要是根據(jù)牛物分子與特定的固相化配基之間的親和力而使牛物 分子得到分離。它是由吸附層析衍生、發(fā)展起來的分離技術(shù)。利用親和層析載體 固相化配基與親和互補物z間通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵作用等發(fā)生 專一

9、性的結(jié)合而進(jìn)行分離。親和層析的載體要選用機械強度高、非特異性吸附少、 水不溶性的、具有較多化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)一輕基的多糖類介質(zhì)，該載體在溫和條件下 與配基共價偶聯(lián)，而乂不影響配基及被分離物質(zhì)原有的牛物學(xué)特性。本實驗采用豬胰蛋白酶的天然抑制劑一雞卵類粘蛋白作為配基從豬胰臟的 粗提液中分離純化朕蛋口酶。三、儀器、原料和試劑器材：紫外分光光度計、核酸蛋白質(zhì)檢測儀、高速組織搗碎機、恒溫水浴搖床、l層析 tt（10mmx100mm）. g3玻璃燒結(jié)漏斗、酸度計、抽濾瓶。原料新鮮豬胰臟試劑1. 環(huán)氧氯丙烷，1, 4二氧六環(huán)，乙烯，乙月青，浪化氧2. 5mol/l 硫酸；3. 5.0mol/l氫氯化鈉4. 0.2

10、mol/lph9.5碳酸鈉緩沖液。5. 親和柱平衡液:0.5mol/l氯化鉀0.05mol/l氯化鈣一o.1mol/l, ph7.8 tris-hci緩沖液；6. 親和柱洗脫液:o.1mol/l甲酸一0.5mol/l氯化鉀,ph2.5混合液;7. ph2.53.0乙酸酸化水。8. sepharose 4b ,雞卵類枯蛋白,純胰蛋白酶。四、操作步驟（一）載體一sepharose4b的活化環(huán)氧氯丙烷活化法：取適量的sepharose 4b,于g3玻坨!燒結(jié)漏斗（簡稱g3漏斗）上抽去保護(hù)液。稱10g（濕重）sepharose 4b,用100ml0.5mol/l氯化鈉溶液淋洗,除 去56pha ros

11、e 4s凝膠內(nèi)的保護(hù)劑，用蒸懈水洗凈，轉(zhuǎn)移到10oml的錐形瓶 內(nèi)。然后加入6.5ml 2.0mol / l氮氧比鈉溶液、15ml環(huán)氧氯丙烷、15ml56% 1, 4二氧六環(huán)，于45°c的恒溫水浴搖床內(nèi)振蕩活化2小吋。然后將活化的凝膠 轉(zhuǎn)移到g3漏斗內(nèi)抽干，用蒸館水洗至ph8.0左右，再用20ml0.1mol/l, ph9.5 碳酸鈉緩沖液淋洗。處理完畢后立即偶聯(lián)。（-）朕蛋口酶粗操液的制備取50g豬新鮮胰臟（除去脂肪和結(jié)締組織）剪碎置于高速組織搗碎機內(nèi)，加 入200ml預(yù)冷的ph2.53.0的乙酸酸化水，勻漿。于10°c提取4小吋以上，4 層紗布過濾，收集濾液并用5mol

12、/l的氫氧化鈉調(diào)至ph8.0,加入終濃度為o.1mol/l氯化鈣及仆2mg胰蛋白酶晶種,置4°c激活12-16小時或在室溫 （25°c左右）激活2-4小時。待朕蛋白酪比活達(dá)到1000-1500 baee單位/ mg 以后，用6mol/l硫酸調(diào)至ph3.0停止激活。放置4°c冰箱內(nèi)備用。測定胰蛋白酶活性。（三）親和層析純化胰蛋口酶取一支層析柱（10mmx100mm）,裝入少量親和柱平衡液（0.5mol/l氯化鉀 0.05mol/l氯化鈣0.1mol/l, ph7.8 trishci緩沖液），將親和吸附劑一次裝 入柱內(nèi)，待親和吸附劑自然沉降至約1/2總體積后，調(diào)節(jié)合適的流速。用親和柱 平衡液平衡。用核酸蛋口質(zhì)檢測儀檢測流出液待基線達(dá)到穩(wěn)定后即可。 取一定體積的蛋白酶粗捉液（30 50ml,視酶液的蛋白濃度及比活而定）調(diào)金 ph8.0.用濾紙過濾，取濾液上柱吸附，然后用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋口 質(zhì)檢測儀檢測流出液，待基線達(dá)到穩(wěn)定后改用親和柱洗脫液（0.1mol/l甲酸 0.5mol/l氯化鉀，ph2.5混合液）洗脫。收集洗脫峰2,測定酶蛋白含量及活 性，層析圖譜，如圖3-9o3圖39親和層析純化朕蛋口酶洗脫曲線平衡液:0.5mol/l 氯化鉀,0.05mol/l 氯化鈣，0.1mol/l, ph7.8tris