血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳及其定量試驗報告

1、實驗名稱血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳及其定量南方醫(yī)科女修生物化學(xué)實驗報告姓 名: 學(xué) 號: 專業(yè)年級: 組 另I:生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心實驗日期實驗地點合作者指導(dǎo)老師評分教師簽名批改日期一、實驗?zāi)康?.1. 學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的基本原理和操作方法;1.2. 了解電泳技術(shù)的一般原理；1.3. 掌握電泳分離血清蛋白質(zhì)及其定性定量的方法。二、實驗原理2.1. 血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋 白（A

2、lbumin）、a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B -球蛋白、丫 -球蛋白5條區(qū)帶。2.2. 血清中不同蛋白質(zhì)的等電點、分子量及含量血清蛋白質(zhì)等電點分子量占總蛋白的清蛋白4.6469,0005772a 1 球蛋白5.06200,00025a 2 球蛋白5.06300,00049B 球蛋白5.1290,000150,0006.512丫 一球蛋白6.857.3156,000950,0001220緩沖液 pH=8.6, pI v pHo血清蛋白帶負電荷，在電場中向正極移動預(yù)測血清蛋白電泳區(qū)帶圖血清蛋白依次分為清蛋白，球蛋白的 a 1、a 2、B、丫五個區(qū)帶2.3. 膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰

3、色帶；各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合 量基本成正比；可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中；用分光光度法計算各種蛋 白質(zhì)的百分數(shù)。三、材料與方法：3.1. 實驗材料：3.1.1. 實驗試劑：樣品：健康人血清（新鮮、無溶血）；巴比妥-巴比妥鈉緩沖液（pH8.6,離子強度0.06mol/L ）;3氨基黑10B染色液；漂洗液；洗脫液： 0.4mol/NaO H 溶液。3.1.2. 實驗器材：V-1100分光光度計（X 1）；恒溫水浴箱（X 1）；試管（X6）、試管架（X 1）；1000卩L加樣槍（X 1）、加樣槍架（X 1）；醋酸纖維薄膜（2cm*8cm厚度120卩m）:培養(yǎng)皿（X 5）;點樣器或載玻片（X

4、 1）；平頭鑷 子（X 2）；剪刀（X 1）；電泳槽（X 1）； ?直流穩(wěn)壓電泳儀（X 1）8cm小組標(biāo)記點樣線m點樣區(qū)（粗面）樣品標(biāo)記2cm1.5cm2.電泳：放置膜條（點樣面向下，點樣端置于陰極）；膜條貼緊濾紙，拉直膜條；平衡五分鐘；通電（調(diào)節(jié)電壓 120v/電流，時間：4560 min）;關(guān)閉電源電泳槽解剖圖:濾紙橋醋酸纖維素薄膜濾紙橋電極槽支架四、結(jié)果與討論:圖一染色后的膜條4.1. 結(jié)果分析本次實驗得到的圖譜只能夠清晰的看出清蛋白和丫 一球蛋白的區(qū)帶，其余無法區(qū)別。原因可能如下： 醋酸纖維薄膜質(zhì)量不足 薄膜過濕，樣品擴散迅速，導(dǎo)致樣品分離不成區(qū)帶。 點樣太少，區(qū)帶顯色不明顯。 電泳時

5、間不足。 薄膜在緩沖液中浸泡的時間不足。 取出電泳后的薄膜過程中曾不慎將薄膜掉到地上。 染色時，因為現(xiàn)場混亂，可能導(dǎo)致醋酸纖維薄膜不是一張一張放入染色液的，在染色 固定前，薄膜與薄膜之間重疊，造成薄膜上還未固定的血清蛋白彼此粘連。4.2. 課后思考題1. 電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？答：點樣端置于電場的負極。因為人體血清的蛋白質(zhì)會因電槽中溶質(zhì)呈堿性而帶負電，要成功分離出各類各類蛋白質(zhì)，理應(yīng)將點樣端置于電場的負極。2. 電泳后各區(qū)帶應(yīng)明顯分開，如分離不清或不整齊，試分析其可能存在的原因答：醋酸纖維薄膜質(zhì)量不足；薄膜過濕，樣品擴散迅速，導(dǎo)致樣品分離不成區(qū)帶;點樣太少，區(qū)帶顯色不明顯；染色時，醋酸纖維薄