間充質(zhì)干細(xì)胞臨床試驗(yàn)中的問題及其解決策略

1、間充質(zhì)干細(xì)胞臨床試驗(yàn)中的問題及其解決策略【摘要】 人間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化特性、免疫調(diào) 節(jié)作用及體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增操作簡便，因此國內(nèi)外多家單位 均開展了 msc臨床試驗(yàn)，以預(yù)防和治療異基因骨髓移植后移 植物抗宿主病，修復(fù)骨和軟骨損傷，治療心肌梗塞和肝臟損 傷等多種疾病。然而，越來越多的資料提示，在制訂臨床應(yīng) 用方案及具體實(shí)施過程中，必須考慮到細(xì)胞培養(yǎng)用動(dòng)物血清 蛋白的內(nèi)在化、植入細(xì)胞體內(nèi)存活以及分化專一性等諸多因 素。本文綜述了臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)中宜注意的問題?！娟P(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞problemati c issuesincl inicaltrialsofmesenchymaistemcellsa

2、n d unravelingstrategiesreviewabstr act withthec apacitiesofm ultiplediffe rentiation,i nnnunoregulat oryactivitie sandeasyhand lingforisola tionandcultu reexpansion, humanbonemar rowmesenchym alstemcells(mscs)havebee nutilizedinc linicaltrial sforthepreve ntionandtreatmentofgraft versus host diseas

3、einall ogeneicbonem arrowtranspl antation,rep airofboneand cartilagedef ectsand trea tment ofcard iacinfarctio rmndliverinj ury. however, increasingly experimental data indicat ethatagreatdealof issues,suchasintraneutralizationofcalfse rumprotelnsi ntoculturedm scs,survival ofengraftedc ellsandsubse

4、 quentcelldif ferentiation tendency, shouldbeinstrin gentconsider ationbeforec linicaltrial saredesigned inthispaper , theseissue sthatshouldb eraisedandso lvedinclinic altrialswith mscs wererev iewed.keywo rdsmesenchym alstemcell； c linica it rial間充質(zhì)干細(xì)胞是一群存在于骨髓、脂肪、骨實(shí)質(zhì)、胎盤 及骨骼肌等多種組織中的干細(xì)胞，具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞

5、和脂肪細(xì)胞分化功能lo此外，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)下，msc可 分化為肌肉細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞2。也有報(bào)告自稱，msc 分化能力接近于胚胎干細(xì)胞，可以分化為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞和肝臟細(xì)胞3-5。研究已經(jīng)證實(shí)，msc支持體外造血并 促進(jìn)造血細(xì)胞體外擴(kuò)增6；同時(shí)，在體外msc本身不引起 異體t細(xì)胞活化，且抑制由非特異性絲裂原或異體淋巴細(xì)胞 激活的t淋巴細(xì)胞增殖7, 80通過密度梯度離心分離低 比重細(xì)胞，利用ms c的貼壁生長特性，從人骨髓中分離msc 的技術(shù)已經(jīng)成熟9。細(xì)胞在體外增殖旺盛，一般而言，獲 取5 ml骨髓分離細(xì)胞，體外培養(yǎng)4-6周后可獲得108以上 msco因此，msc在造血細(xì)胞移植、器官移植、骨

6、和軟骨組織 修復(fù)、心肌梗死和肝臟損傷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，某些治 療措施已經(jīng)進(jìn)入臨床試用階段。目前，美國國家食品藥品管 理局已經(jīng)批準(zhǔn)msc輸注進(jìn)入ii期臨床試驗(yàn)，以期減輕異基因 骨髓移植中的移植物抗宿主反應(yīng)。此外，fda批準(zhǔn)的有關(guān)msc 細(xì)胞治療的臨床方案包括：©msc靜脈輸注治療crohn??； ®msc局部應(yīng)用治療牙周疾?。?#174;msc靜脈輸注治療心肌梗 死；msc修復(fù)半月板及g csf動(dòng)員的骨髓msc治療心 肌梗塞等。國內(nèi)的臨床研究中適應(yīng)證的選擇更為廣泛，利用 自體或異體msc預(yù)防或治療gvhd、心肌梗死、骨或軟骨缺損、 糖尿病足壞疽、肝臟損傷或股骨頭壞死等，多家

7、單位的研究 已經(jīng)進(jìn)入臨床試用階段。但是，必須指出的是，有些臨床試 驗(yàn)尚需要充分的理論支持，有關(guān)msc體外培養(yǎng)體系的標(biāo)準(zhǔn)化 以及體內(nèi)存活及分化趨向等，仍需要通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)進(jìn)一步 闡明。本文將提出相關(guān)問題，并對相應(yīng)解決策略進(jìn)行討論。人骨髓中ms c的含量很低，因此臨床應(yīng)用前必需進(jìn)行細(xì) 胞的體外擴(kuò)增。目前國內(nèi)外移植中心或?qū)嶒?yàn)室所報(bào)道的人骨 髓ms c分離方法，均基于msc的貼壁特性去除其它細(xì)胞，msc 增殖為由紡錘形細(xì)胞組成的致密貼壁層。連續(xù)傳代本身就是 細(xì)胞純化的過程，由于msc的增殖優(yōu)勢，血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞 隨著傳代培養(yǎng)而被剔除，同時(shí)msc進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增階段，最終 細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)1億倍以上。但是，由于初

8、始接種細(xì)胞成分不同， 培養(yǎng)體系組成的差異諸如血清濃度及血清種類差別以及細(xì) 胞因子的添加與否及添加成分等等，這些均可影響最終細(xì)胞 產(chǎn)品的純度和具體功能。事實(shí)上，將單個(gè)msc接種于常規(guī)培 養(yǎng)體系中，使之形成成纖維細(xì)胞集落形成單位，集落內(nèi)細(xì)胞 形態(tài)均一，細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等多種系列特異性的mrna。因此，體 外培養(yǎng)的所謂ms c只是一個(gè)形態(tài)和表型相對均一、分化潛能 和所處發(fā)育階段迥乎差異的細(xì)胞群體10。此外，培養(yǎng)中的人骨髓msc細(xì)胞間的體外增殖能力和植 入能力也有很大差別。david等11發(fā)現(xiàn)，形態(tài)上體積小 而增殖較快的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)初期有很強(qiáng)的自我更

9、新能力, 細(xì)胞倍增速度快；而體積大的細(xì)胞增殖速度則較慢。stro 1陽性細(xì)胞可能更易于植入骨髓、肌肉、脾臟等組織，而陰 性細(xì)胞易于滯留于肺循環(huán)12。到目前為止，人們尚未建立一種被多數(shù)研究單位廣泛接 受的統(tǒng)一流程，進(jìn)行規(guī)模化的人骨髓msc分離純化及擴(kuò)增。 通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，觀察不同種類血清、血清濃度、細(xì)胞 因子、細(xì)胞生長因子、不同培養(yǎng)液乃至不同產(chǎn)地的培養(yǎng)瓶等 可能影響人msc生長及分化的多種因素對最終所獲細(xì)胞功能 的具體影響，參考“人體細(xì)胞與基因治療規(guī)范”，建立適合 臨床應(yīng)用的人msc分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。動(dòng)物血清蛋白內(nèi)在化必須指出的是，目前廣泛應(yīng)用的人骨髓msc培養(yǎng)體系多 采用胎牛血清，而殘

10、存的胎牛血清本身可引起嚴(yán)重的免疫反 應(yīng)。在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白 分子細(xì)胞內(nèi)在化，即使通過洗滌也不能清除牛血清蛋白。一 般而言，體外培養(yǎng)收獲108 msc,其殘存的胎牛血清蛋白量 在7-3 omg之間，多次輸注時(shí)存在并發(fā)血清病的危險(xiǎn)13 , 必然干擾治療效果及其評估。因此，建立一種無異種血清的 人骨髓msc培養(yǎng)體系，是開展相關(guān)細(xì)胞治療必需的基礎(chǔ)。為此，有人嘗試應(yīng)用血清替代品體系進(jìn)行人骨髓msc培 養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在無血清體系中，細(xì)胞能保持其多向分化特性，增 殖速度較傳統(tǒng)體系下更為旺盛14。但是，血清替代品中 多含有牛血清白蛋白，它是主要蛋白質(zhì)成分之一，無血清培 養(yǎng)體系雖能保證細(xì)

11、胞培養(yǎng)批次及實(shí)驗(yàn)室間的穩(wěn)定性，仍不能 從根本上解決異種蛋白內(nèi)在化問題。采用自體血清或血漿， 或許是解決這一問題的根本途徑15。另外，利用人ab血 清或血漿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)也往往能達(dá)到擴(kuò)增骨髓msc的目的。msc的植入與存活在骨和軟骨組織構(gòu)建中，m sc是修復(fù)骨/軟骨缺損理想 的種子細(xì)胞。實(shí)際應(yīng)用中，常將自體骨髓msc接種于一定大 小和形狀可降解生物材料上。這些材料主要成分有多聚乳酸、 多聚乳糖酸或釋基磷灰石。之后，將含細(xì)胞的生物材料植入 機(jī)體組織缺損部位。細(xì)胞在局部微環(huán)境的誘導(dǎo)下能較為特異 地向某一組織分化，而生物材料逐漸被機(jī)體吸收或自發(fā)降解。 新生組織經(jīng)過重塑后，即可形成完整的組織結(jié)構(gòu)，損傷組織

12、 的功能得以恢復(fù)。然而，msc植入后脫離了特殊的培養(yǎng)環(huán)境，而通過微循 環(huán)滲透方式所獲營養(yǎng)成分所及的范圍在100-2 ooiim之間。 因此，植入細(xì)胞大部分因營養(yǎng)缺乏而很快死亡，細(xì)胞并不能 發(fā)揮其增殖分化功能。從已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究資料看，單純 應(yīng)用msc復(fù)合生物材料，不能很好地修復(fù)較大的骨缺損16。 臨床試驗(yàn)長期隨訪發(fā)現(xiàn)，也有部分病例出現(xiàn)骨吸收現(xiàn)象。因 此，通過基因修飾或配伍應(yīng)用生長因子等手段，促進(jìn)植入細(xì) 胞的存活和定向分化以及新生組織血管形成，可能是解決ms c作為種子細(xì)胞在骨組織修復(fù)中生存的有效途徑。在設(shè)計(jì)msc治療其它疾病如gvhd、心肌梗死等的臨床方 案時(shí)，也要面對細(xì)胞植入和存活率問題。

13、目前人們普遍認(rèn)為, 靜脈輸注的骨髓、外周血?jiǎng)訂T或體外培養(yǎng)msc,只有極少數(shù) msc能植入受者體內(nèi)，多數(shù)細(xì)胞滯留于微血管處而死亡17 o 體外培養(yǎng)的msc并不是表型和功能均一的細(xì)胞群體，stro1陽性細(xì)胞可能更易于植入骨髓、肌肉、脾臟等組織，而陰 性細(xì)胞易于滯留于肺循環(huán)12。因此，提高msc抵抗低營 養(yǎng)的能力，或探索合適的細(xì)胞亞群進(jìn)行輸注，可能是提髙msc 體內(nèi)植入效率，從而發(fā)揮體外近似的效應(yīng)。msc的分化特性與治療目的的一致性造血重建是確定一群細(xì)胞是否含有造血干細(xì)胞的重要標(biāo)準(zhǔn)。以此推論，如能通 過移植手段達(dá)到間充質(zhì)組織重建，即可認(rèn)為某一群細(xì)胞內(nèi)含 有msc。然而，成體內(nèi)msc含量極低，在骨髓中

14、約為造血干 細(xì)胞含量的1/10,通過輸注動(dòng)員的外周血或骨髓移植物的方 法，不能將足夠量的供者源msc移植給受體。更為重要的是， 由于成體間充質(zhì)組織更新代謝水平較造血組織低，可能更高 比例的間充質(zhì)干細(xì)胞處于g0期，不易被常規(guī)劑量的放射或 化療藥物所清除。因此，組織重建不適合于對msc的判定。 目前，確定msc的“金標(biāo)準(zhǔn)”都建立在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 即細(xì)胞自我更新能力和多向分化特性，包括形成骨細(xì)胞、軟 骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力18。在體外實(shí)驗(yàn)中，msc很難向 具有功能的神經(jīng)元19、肝臟細(xì)胞和肌肉細(xì)胞20 分化。 因此，通過自體或異體msc輸注，治療神經(jīng)損傷、肝臟損傷 或心肌梗塞等疾病，似乎缺乏詳盡的

15、理論支持。但是，局部或靜脈輸注msc治療非中胚層組織損傷，也 可能具有一定的效果。其機(jī)理可能體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： msc可以分泌大量的促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的因子，如肝細(xì)胞生 長因子、神經(jīng)細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等21； msc與損傷細(xì)胞的融合，可部分發(fā)揮某一特定細(xì)胞的功能; ®msc的免疫抑制效應(yīng)減輕了因組織壞死引起的局部炎性反 應(yīng)22。總之，msc的多向分化特性、免疫調(diào)節(jié)作用及體外分離 培養(yǎng)擴(kuò)增操作簡便性，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。然而在具 體的臨床應(yīng)用過程中，必須注意細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化、植入細(xì) 胞的存活以及細(xì)胞固有的分化特性等問題；臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)必 須有充分的理論支撐。只有如此，

16、方可為msc相關(guān)細(xì)胞治療 或組織構(gòu)建替代治療，找到合適的臨床適應(yīng)證?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】igu oz,lih,lix,e tai. invitroc haracteristi csandinvivoi mmunosuppressiveactivity ofcompactbon e derivedmes enchymalprog enitorcells stemcells , xx ；24：992-10002郭子寬，劉曉丹，劉曉丹等人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外 分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，20 01； 9： 91-923 caoy,sunz,li ul,etai. huma nadiposetis

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