實時熒光定量PCR原理和實驗

1、實時熒光定量pcr 原理和實驗所屬分類 : 基因檢測更多見無論是對遺傳病 (如地中海貧血和血友病)、 傳染病 (如肝炎和艾滋病)或腫瘤進(jìn)行基因診斷， 還是研究藥物對基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量pcr 技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量pcr 技術(shù)的最新進(jìn)展是 實時熒光定量 。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測pcr 產(chǎn)物， 一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到pcr 每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定 ct 值，從而根據(jù) ct 值確定起始 dna 拷貝數(shù)，做到了真正意義上的dna 定量。 這是 dna 定量技術(shù)的一次飛躍。根據(jù)最終

2、得到的數(shù)據(jù)不同，定量pcr 可以分為相對定量和絕對定量 兩種。典型的 相對定量 如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。 根據(jù)所使用的技術(shù)不同， 熒光定量 pcr又可以 分為 taqman 探針和 sybr green i 熒光染料 兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實驗設(shè)計更為簡便。 在選擇實驗方案時要根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學(xué)要求并對數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正， 以消除偶然誤差。 因此重復(fù)

3、實驗和設(shè)立內(nèi)對照非常重要。 由于各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然，與定性實驗一樣，定量pcr也要設(shè)立陰性和陽性對照，以監(jiān)控試劑和實驗操作方面可能出現(xiàn)的問題。1 為什么終點定量不準(zhǔn)確？我們都知道理論上pcr 是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的 pcr擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是s 形曲線。這是因為隨著 pcr循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，taq 酶、dntp、引物，甚至 dna 模板等各種pcr要素逐漸不敷需求，pcr的效率越來越低， 產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的 taq 酶都被飽和以后， pcr就進(jìn)入了平臺期。 由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不

4、同的pcr 反應(yīng)體系進(jìn)入平臺期的時機(jī)和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復(fù)實驗，各種條件基本一致，最后得到的dna 拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動很大（圖 1） 。圖 1 同一個樣本重復(fù)96 次 pcr的擴(kuò)增曲線傳統(tǒng)的定量方法， 如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測定的都是pcr的終產(chǎn)物，而不是起始dna 拷貝數(shù)。由于pcr 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的pcr產(chǎn)物量不能計算出起始dna 拷貝數(shù)。對于絕大多數(shù)實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測等，需要測定的都是pcr放大之前標(biāo)本中的dna 原始拷貝數(shù)，經(jīng)過pcr 擴(kuò)增以后的 dna 拷

5、貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實情況。在這種情況下，就不能采用終點定量， 而要根據(jù) ct 值確定 dna 起始拷貝的數(shù)量。2 為什么 ct 值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？ct 值的定義是 pcr擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖 1 的重復(fù)實驗中可以直觀地看到，盡管平臺期dna 拷貝數(shù)波動很大， ct 值卻是相對固定的。如果用不同濃度的dna 作 pcr，可以看出 dna 濃度越高， ct 值越小。 dna 濃度每增加 1 倍，ct 值減小 1 個循環(huán)。ct 值與模板 dna 的起始拷貝數(shù)成反比。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡便， 以下推導(dǎo)忽略 pcr

6、效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以在方程上增加修正項。這些修正項的增加并不改變方程的線性性質(zhì)。一般，我們有rn=rb+xo(1+ex)nrs, 也就是說第 n 次 pcr循環(huán)時的熒光信號強(qiáng)度(rn)等于背景信號強(qiáng)度(rb)加上每個分子的熒光強(qiáng)度 (即單位熒光強(qiáng)度， rs)與分子數(shù)目的乘積。 當(dāng)循環(huán)次數(shù) n = ct時，則有 rt=rb+xo(1+ex)ctrs 。兩邊取對數(shù)，得 log(rt -rb) = logx0 + ctlog(1+ ex) + logrs。整理此式，ctlog(1+ ex) = - logx0 + log(rt -rb)-logrs. 所以對于每一個特定的pcr 反應(yīng)來

7、說， ex、rt、rb 和 rs都是常數(shù)，所以ct 值與 log x0 成反比，也就是說，ct 值與起始模板拷貝數(shù) (x0)的對數(shù)成反比，起始dna 濃度每增加1 倍，ct 值減小 1 個循環(huán)。根據(jù) ct 值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點定量則比較粗放。如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè)pcr 的效率 (即 ex)為100% ，從上式推算出定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳斜率和ct 值的最佳范圍。3 怎樣確定 ct 值？實驗操作中， ct 值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時所對應(yīng)的pcr循環(huán)次數(shù)（圖 2） 。 “基線上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的

8、 10 倍。閾值所在的橫線與pcr 擴(kuò)增曲線的交點所指的pcr循環(huán)次數(shù)就是ct 值?；€范圍的定義是從第3 個循環(huán)起到ct 值前 3 個循環(huán)止，其終點要根據(jù)每次實驗的具體數(shù)據(jù)調(diào)整，一般取第 3 到第 15 個循環(huán)之間。早于3 個循環(huán)時，熒光信號很弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大，不是真正的基線高度；而在 ct 值前 3 個循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號已經(jīng)開始增強(qiáng)，超過了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來處理。圖 2ct 值和閾值顯然， ct 值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量， ct 值是一個完全客觀的參數(shù)。ct 值越小， 模板 dna的起始拷貝數(shù)越多；ct 值越大，模板dna

9、 的起始拷貝數(shù)越少。正常的 ct 值范圍在 18-30 之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。4 熒光信號和定量數(shù)據(jù)的歸一化雖然大多數(shù)定量pcr 儀都會自動扣除本底，但是仍然需要注意熒光信號強(qiáng)度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不同樣本之間的實驗數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。由于加樣操作的誤差、 離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號必須進(jìn)行歸一化校正， 以消除這些因素對定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來實現(xiàn)，一般采用紅色 rox 熒光，稱為陽性參比信號。rox 在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和

10、總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。 目標(biāo)基因和對照基因的信號除以陽性參比信號以后，即 rn = r / rrox，就可以在同樣的起點上進(jìn)行比較和各種計算。rox校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖 3） 。圖 3 rox 熒光校正（左）和不校正（右）對實驗數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號再扣除本底，就得到drn：drn = rn, 樣本- rn,空白。 drn 是最后構(gòu)建 pcr實時擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)。無論絕對定量還是相對定量，在得到實驗結(jié)果后， 還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。在實驗操作中， 取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝 /l 或拷貝

11、/ng 的定量數(shù)據(jù)相互之間實際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細(xì)胞或拷貝 /基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋硗瓿?。參比一般選用b-actin 、gapdh、rrna 基因等管家基因 。由于它們在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。校正方法為： dna 樣本/ dnaipc ，或者 dct = ct,樣本- ct, ipc。因為 ct 值與起始 dna 拷貝數(shù)的對數(shù)是反比關(guān)系，可以證明， 這兩種計算方法在數(shù)學(xué)上是等價的。為了減少誤差， 目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進(jìn)

12、行定量測定，所以這種對照稱為陽性內(nèi)對照(internal positive control ，ipc)。要進(jìn)行 ipc 歸一化校正，定量pcr儀必須具備多色檢測能力，最好是4 色。否則，目標(biāo)基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。5 污染的預(yù)防和熱啟動為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性pcr擴(kuò)增和污染 。常用的 措施有使用 ung酶(uracil-n-glycosylase) 和熱啟動 。 ung酶的作用原理是降解含有du 的雙鏈或單鏈dna。 它在 50c激活， 95c滅活。由于商用pcr試劑盒均以 dutp 取代 dttp，所以 pcr產(chǎn)物都是含有du 的 dna 鏈。在定量

13、 pcr開始前增加50c的保溫步驟， ung 酶即可將已有的pcr產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。普通的 taq 酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入 pcr試劑的過程中、正式pcr開始前就會完成少量pcr擴(kuò)增，增加了背景， 影響定量精度。 而金牌 taq酶經(jīng)過特殊修飾，常溫下其活性部位被封閉，沒有活性； 只有經(jīng)過 95c 10 min 的熱啟動以后，封閉被解除，才能開始dna 鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實驗和陰性、陽性對照定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實驗，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理， 可以將誤差降低到最小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復(fù)

14、3 次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)68 次，以滿足小樣本統(tǒng)計的要求。如果作絕對定量， 則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在5 個點以上。 標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的 dna 樣本，可以自己制備，也可以購買商品化的試劑盒。其 pcr反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同一反應(yīng)板上同時定量。陰性對照 中不加模板 dna，而以水或緩沖液代替，用于檢驗是否存在 pcr污染。陽性對照 則用于檢驗 pcr試劑和實驗操作上可能出現(xiàn)的問題。如果實驗中設(shè)立了ipc，則 ipc 既可以用來校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽性對照的作用。7 taqman 探針技術(shù)原理taqman 探針法是高度特異的定量pcr技術(shù)，其核心是利用taq 酶的 3

15、5外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的 強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量 。在 taqman 探針法的定量pcr反應(yīng)體系中，包括一對pcr引物和一條探針。 探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有報告基團(tuán)(reporter , r)，如fam、vic 等， 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(quencher , q)，如tamra等。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收， 儀器檢測不到信號。 隨著 pcr的進(jìn)行， taq 酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其35外切核酸酶活性就會將探針切斷， 報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其

16、能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號（圖4） 。所以，每經(jīng)過一個pcr循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強(qiáng)度就代表了模板dna 的拷貝數(shù)。圖 4 taqman 探針的熒光信號產(chǎn)生機(jī)制taqman 探針根據(jù)其 3端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的taqman 探針和 taqman mgb 探針。 mgb探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(non-fluorescent quencher)，本身不產(chǎn)生熒光， 可以大大降低本底信號的強(qiáng)度。同時探針上還連接有 mgb (minor groove binder)修飾基團(tuán)（圖5） ，可以將探針的 tm 值提高 10c左右。因此

17、為了獲得同樣的tm 值，mgb探針可以比普通taqman 探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的dna 堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，taqman mgb 探針對于富含a/t 的模板可以區(qū)分得更為理想。圖 5 taqman mgb 探針8 sybr green i 熒光染料技術(shù)原理sybr green i 是一種只與 dna 雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6） 。當(dāng)它與 dna 雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從dna 雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈dna 分子的數(shù)量。sybr green 熒光染

18、料法定量pcr的基本過程是： 1、開始反應(yīng)，當(dāng) sybr green 染料與 dna 雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、dna 變性時，sybr green 染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成pcr產(chǎn)物。4、 聚合完成后，sybr green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量pcr系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。圖 6 sybr green i 熒光染料與 dna 雙鏈的結(jié)合sybr green i 熒光染料能與所有的dna 雙鏈相結(jié)合，對dna 模板沒有選擇性， 所以特異性不如taqman 探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對pcr引物設(shè)計的特異性和pcr反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較

19、高。在此前提下， 本法是一種成本低廉的選擇。9 定量 pcr儀簡介目前在國內(nèi)使用得比較多的熒光實時定量pcr儀有美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 (applied biosystems ， abi)的 7000、 5700、 7900、7700 型和羅氏公司的lightcycler 等。下面以 abi 最新推出的7000 型為例作簡單介紹。7000 型熒光定量 pcr儀設(shè)計滿足臨床檢驗、醫(yī)學(xué)研究和基礎(chǔ)實驗的要求， 面向低通量至中等通量的用戶。隨機(jī)配置的定量pcr引物和探針設(shè)計軟件primer express 非常有用，因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設(shè)計定量pcr所需的 taqman 探針。7000 型

20、有實時動態(tài) (real-time) 和終點讀板 (plate read) 兩種運行模式。 實時動態(tài)模式用于定量， 測定 dna 或 rna 拷貝數(shù)。7000 型可以動態(tài)顯示pcr擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于 7 個數(shù)量級，區(qū)分5000 和 10000 個拷貝的 dna 模板可信度達(dá) 99.7% 。終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷酸多態(tài)性（ snp）分析等。當(dāng)然， 7000 型也可以作為普通pcr儀使用。 abi 已經(jīng)發(fā)布 12 萬個商品化的定量pcr試劑盒，覆蓋人類全部 4 萬個基因，平均每個基因3 個檢測試劑盒，為運用7000、7700、7900 型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳

21、的條件。7000 型最大特色是具備多色檢測能力，熒光檢測的波長范圍為 530590 nm ，能夠有效地分辨famtm / sybr? green i 、victm / joetm 、tamratm和 roxtm 等熒光染料。多色熒光檢測技術(shù)為多重定量、 snp分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對照的陰/陽性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時對多個目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。7000 型支持兩種定量化學(xué)：taqman 熒光探針和 sybr green i 熒光染料。其熔解曲線(dissociation curve) 功能用于判斷 pcr擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無雜帶生成。進(jìn)一步閱

22、讀材料基本方法1 lie, y . s. and c. j., petropoulos. advances in quantitative pcr technology: 5nuclease assays. curr opin biotechnol 9: 43-48. 1998.2 orlando, c., p., pinzani, and m., pazzagli. developments in quantitative pcr. clin chem lab med 36: 255-269. 1998.絕對定量 3 becker k., d. pan and c.b. whitley. 1

23、999. real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. hum. gene ther . 10: 2559-2566, 1999.4 de kok, j.b., hendriks, j.c., van solinge, w.w., willems, h.l., mensink, e.j., and swinkels, d.w. use of real-time quantitative pcr to compare dna isolation methods. clin.chem. 44(10): 2201-2204, 1998. 5 wang x., x. li, r.w. currie, r.n. willette, f .c. barone and g.z. feuerstein. application of re