不同產(chǎn)地大豆SOD的提取及活性比較

1、不同產(chǎn)地大豆SOD勺提取及活性比較1 引言SOD是生物體內(nèi)一種非常重要的金屬酶，廣泛存在于各種生 物體中。同時也是一種重要勺抗氧化劑， 它勺作用底物是超氧陰 離子？02-，催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應，從而清除？02-自由基1，2。目前SOD已在多個領域中被應用，比如醫(yī)療保健 3、 食品工業(yè)4、以及植物抗逆5等。植物來源SOD的分離純化 68主要工藝流程為：植物-精制-超濾濃縮-冷凍干燥-產(chǎn)品。 SOD勺活性測定方法一般分直接測定法和間接測定法9-11。常見的直接測定方法有 EPR法、脈沖輻解法、超氧化鉀法等。常見 勺間接測定方法有黃嘌呤氧化酶法、 細胞色素法、 鄰苯三酚自氧 化法、微量鄰苯三酚

2、自氧化法、黃嘌呤氧化酶 -NBT法、NBT光還 原法等。鄰苯三酚自氧化法勺主要原理為：在堿性條件下，鄰苯 三酚發(fā)生自氧化反應，并產(chǎn)生 ？O2,在SOD存在下，自氧化反應 受到抑制。 該法所用試劑和儀器比較普通， 測試方便， 靈敏度高， 是目前應用最廣泛的一種測試方法，但對溫度、pH值、鄰苯三酚濃度、SOD寺測液存放時間等諸因素比較敏感，因此測定時要 嚴格控制這些因素 12 14。筆者提取了大豆中的SODS,然后利用改良的鄰苯三酚自氧 化法對大豆的SOD酶活性進行了測定，對測定過程中的各個條件 進行了探索，建立了大豆SOD酶測定最佳方法，并對不同產(chǎn)地大豆的SOD舌性進行了比較，使SOD在規(guī)?；?/p>

3、產(chǎn)的同時更具針對 性。2 材料與方法2.1 材料和儀器本實驗所使用的大豆樣品來源于 9 個產(chǎn)地，分別為：廣東（廣 州）、北京、江蘇（動臺）、黑龍江（佳木斯）、黑龍江（牡丹 江）、福建（廈門）、廣西（柳州）、湖北（武漢）、湖南（長 沙）。對應的編號分別為19。實驗材料：Tris base（國藥集團化學試劑 XX公司，優(yōu)級純）；其余試劑均為分析純。 A液：稱取1.2114 g Tris 和37.2 mgEDTA?2N溶于62.4 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100mL B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。實驗儀器：紫外可見分光光度計（UEG1008016上海美譜達 儀

4、器XX公司）；微型酸度計（PHSJ-3F,上海精科）；高速離心 機（TGL-20M長沙平凡儀器儀表 XX公司）；超純水系統(tǒng)（Aquaplore3S，頤洋企業(yè)發(fā)展 XX公司）。2.2SOD酶提取與處理2.2.1 粗酶液的提取將大豆種子洗凈淋干，于 pH值為7.8的PBS緩沖液中浸泡10 h。清洗后加入4C三倍體積的預冷緩沖液，在冰上勻漿。勻 漿后加入一定量的緩沖液， 在超聲波清洗機中超聲， 使細胞破碎， 得到粗酶液。2.2.2SOD 粗酶液的處理熱變性：分別取一定體積的粗酶液，放入60C的水浴鍋中分別保溫10、15、20 min，在5000 r/min、4C的離心條件下離 心 15 min 去除

5、沉淀，測定上清液中酶活力及蛋白含量，篩選熱 變性的最佳時間。丙酮沉淀：取一定體積的酶液，置于冰浴中，緩慢加入-20C 預冷的丙酮，攪拌10 min ,4C下靜置5 h,待其自然沉淀后，4C、 5000 r/min 離心 15 min 棄去上清液，收集沉淀，用緩沖液溶解 沉淀，4C、5000 r/min離心15 min后測定上清液酶活力和蛋 白含量。2.3 酶活性與濃度的測定2.3.1 酶活力的測定鄰苯三酚自氧化速率測定嚴格控制在25 C進行。于15 mL比色管中用微量移液器依次加入 A液2.35 mL,蒸餾水2.015 mL, B液0.35 mL。加入B液后立即混合并傾入比色皿，于325 nm

6、處測吸光值，共測 4次，即取開始后 30s 和 90s 時的吸光值，二者 之差即為鄰苯三酚自氧化速率厶 A325本試驗確定 A325值為 0.060。測定樣液和SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率時樣品的 加入順序如表 1 所示，分別加入一定量樣液或酶液使鄰苯三酚自 氧化速率約為0.5倍A325,即厶A 325為0.030。2.3.2 蛋白質(zhì)濃度的測定采用紫外分光光度法測蛋白質(zhì)濃度，禾U用在280 nm及260 nm下的光吸收值計算蛋白質(zhì)的濃度，公式如下：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL =1.45 XA280-0.74 XA260式中:A280是蛋白質(zhì)溶液在280 nm下測得的光吸收值；A260 是蛋白質(zhì)

7、溶液在 260 nm 下測得的光吸收值。2.3.3SOD 的定性分析采用紫外分光光度法：分離后的酶液與Cu/Z n-SOD標品分別 在200400 nm處進行紫外光譜掃描，根據(jù)樣品與標品的紫外圖 譜比較， 對提取物質(zhì)進行定性， 同時根據(jù)其最大吸收峰的波長來 判斷SOD的類型。2.4SOD酶提取條件的優(yōu)化2.4.1 超聲時間的優(yōu)化分別對勻漿超聲波處理 1 min， 2 min， 3 min， 4 min， 5 min 后，使用紫外分光光度法測定蛋白的濃度，并用改良的 ?苯三酚 自氧化方法測定酶的活力。2.4.2 熱變性時間的優(yōu)化取三份100 mL粗酶液，60C條件下對其進行熱處理，時間分別為10

8、 min、15 min、20 min，邊加熱邊用玻璃棒輕輕攪拌， 加熱完成后，迅速放入4C冰浴冷卻30 min,然后在5000 r/min、 4C下離心15 min，取上清液，分別測酶活和蛋白質(zhì)含量。2.4.3 丙酮用量的優(yōu)化取熱變性以后的酶液，置入 4C冰浴中，分別加入1.0倍、 1.5倍、2.0倍體積的-20C預冷丙酮進行沉淀。丙酮要緩慢加入， 并用玻璃棒輕輕攪拌， 以防止丙酮局部過量以及溶液產(chǎn)生大量的熱量而使蛋白質(zhì)變性。2.5不同產(chǎn)地大豆的SOD酶的提取與比較利用上述提取方法對全國9個產(chǎn)地的大豆進行SODB的提取 及酶活的測定。3.2.3 丙酮加入量對酶活的影響檢測結(jié)果如表 3，當丙酮加

9、入量為 1.5 倍時酶活收率與比活 力最高，因此本實驗將丙酮加入量定為 1.5 倍體積。3.3SOD活性的測定優(yōu)化3.3.1A液pH值對鄰苯三酚自氧化速率的影響檢測結(jié)果如表 4 所示。 從表中數(shù)據(jù)可以看出， 鄰苯三酚自氧 化速率隨pH的升高而增大，在pH值在88.4范圍內(nèi)，曲線幾 乎不變，斜率較低，pH變化對鄰苯三酚自氧化速率的影響不大。 當pH值超出此范圍時，曲線斜率變大，微小的pH變化都會顯著 影響鄰苯三酚自氧化速率。本實驗 A液最佳PH值定為8.2。3.3.2 鄰苯三酚加入量對測量的影響4 討論及結(jié)論大豆樣品經(jīng)粗提取和熱變性、 丙酮沉淀后的蛋白質(zhì)紫外光譜 如圖1 (b)所示。由圖1可以看

10、出Cu/Zn-SOD標準品圖1 (a) 與樣品圖譜的走勢、 峰形及出峰位置基本一致， 可確定提取物質(zhì) 為SOD圖形的差異是由于 Cu/Zn-SOD的來源不同，標準品來源 于牛血細胞，出峰位置在 258 nm處，而待測樣品來源于大豆， 出峰位置在 260 nm。SOD勺測活方法有很多，在這些方法中，鄰苯三酚自氧化法 儀器簡單、測試方便，因而是使用較普遍的一種方法。目前采用 勺鄰苯三酚測活方法有兩種，一種是經(jīng)典勺鄰苯三酚自氧化法， 另一種是改進的微量鄰苯三酚自氧化法。 本文SOD舌性的測定采 用后者，該方法以修改的 Marldund方法廣泛用于食品中 SOD舌 性測定，方法靈敏，操作簡易，易于推廣。超聲波實驗的結(jié)果顯示，最佳的超聲波時間是4 min。因為在一定的條件下， 超聲波時間過短不能使細胞破碎， 因而其中的 酶不能完全溶出； 因為大多數(shù)酶也是蛋白質(zhì)， 如果超聲波時間過 長就會破壞蛋白的結(jié)構(gòu)， 酶也就會失去活力。 故超聲波時間應該 嚴格控制。 熱變性試驗可以去除一定量的雜質(zhì)蛋白， 熱變性的過 程中不需要接觸有機溶劑， 在節(jié)省成本的同時， 減少了對環(huán)境和 人體的危害， 增加了工作的安全性， 所以熱變性法是去除雜蛋白 的一種高效、簡便、安全的方法。丙酮沉淀方法的優(yōu)勢在于丙酮 本身為易揮發(fā)的有機溶劑， 離心除去上清后沉淀， 避免了透析等 一系列的繁瑣步驟， 可以直接干燥而得到最