試劑盒提DNA的原理

1、試劑盒提 DNA 的原理基因組 DNA 提取試劑盒簡介DNA 是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，為了進(jìn)行測序、雜交、基因表達(dá)、文庫構(gòu)建等試驗(yàn)，獲得高分子量和高純度的基因組 DNA 是非常重要的前提，因此基因組DNA 的提取也是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作之一。Solarbio 公司提供各種不同樣品基因組 DNA 提取試劑盒，如植物、動(dòng)物、細(xì)菌、細(xì)胞、血液、酵母等基因組DNA 提取試劑盒。所提取的基因組純度高，片段大小在 50kb 左右。用戶可根據(jù)需要選用不同的 試劑盒來進(jìn)行不同樣品的抽提。一、基因組 DNA 提取的原則1、保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性

2、 (因?yàn)檫z傳信息全部儲(chǔ)存在核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基層 )。2、排除其它分子(如蛋白質(zhì)、多糖,、脂類、有機(jī)溶劑等)的污染，使 下游試驗(yàn)順利進(jìn)行。二、基因組 DNA 提取的原理和方法DNA 與組蛋白構(gòu)成核小體，核小體纏繞成中空的螺旋管狀結(jié)構(gòu)，即染色絲，染色絲再與許多非組蛋白形成染色體。染色體存在于細(xì)胞核中，外有核膜及胞膜。從組織中提取 DNA 必須先將組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色體釋放出來，同時(shí)去除與 DNA 結(jié)合的組 蛋白及非組蛋白。1、樣品預(yù)處理從各種不同來源的樣品 ( 如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)植物組織細(xì)胞等 )中提取高純度的基因組 DNA，

3、因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所成分不同，樣品預(yù)處理方式也不同，以下簡單介紹常用提取材料的預(yù)處理方式，若需詳細(xì)了 解，請參考本公司各基因組 DNA 提取試劑盒說明書。部分樣品預(yù)處理方式植物材料液氮研磨動(dòng)物材料勻漿、液氮研磨培養(yǎng)細(xì)胞蛋白酶 K 處理 細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液紅細(xì)胞裂解液去紅細(xì)胞2、細(xì)胞裂解CTAB 法：適用于植物組織、真菌等。CTAB 是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中(>0.7M NaCl) 是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。SDS 法：適用于細(xì)菌、血液、酵母、動(dòng)物組織、細(xì)胞等

4、。SDS 是一種陰離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞，使蛋白質(zhì)變性、 染色體解析。其它裂解方法：物理方式：機(jī)械剪切、超聲波破碎、研磨勻漿等 化學(xué)方式：異硫氰酸胍、堿裂解等酶法：蛋白酶 K3、DNA 分離純化純化要求：核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶(如核酸內(nèi)切酶、DNA 聚合酶等)有抑制作用 的成分。其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、多酚和脂類分子等污染應(yīng)降低到最 低程度。排除其它核酸分子的污染，如提 DNA 時(shí)應(yīng)去除 RNA，反之亦然。純化方法：細(xì)胞破碎后，常使用吸附材料結(jié)合方法去除雜質(zhì)和純化 DNA ，主要有硅基質(zhì)材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。因硅基質(zhì)材料可特異吸附核酸 DNA，使用方便、快捷，不需要使

5、用有毒溶劑如酚、氯仿等，使得提取基因組像過濾一樣簡單，因此硅基質(zhì)材料成為大規(guī)模分離純化 DNA 的通用方法。硅基質(zhì)材料吸附核酸的原理：主要利用 DNA 在高鹽低 pH 值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料相結(jié)合，在低鹽高 pH 值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料脫離的特征。其機(jī)理可能是高濃度鹽離子破壞了硅基質(zhì)水分子結(jié)構(gòu)，形成陽離子橋，當(dāng)鹽被清除后，再水化的硅石破壞了基質(zhì)和 DNA 之間的吸引力， 因而 DNA 從硅基質(zhì)上被洗脫下來。注意事項(xiàng)：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破 壞。減少化學(xué)物質(zhì)對(duì) DNA 的降解，為避免過酸、過堿對(duì) DNA 雙鏈中磷酸二 酯鍵的破壞，操作多在 pH 值 4.0-10

6、.0 的條件下進(jìn)行。防止基因組 DNA 的生物降解，主要是 DNase 降解基因組 DNA，DNase需二價(jià)金屬陽離子如 Mg2+ 等的激活，可用 EDTA 等金屬離子螯和劑螯 和 Mg2+ 以抑制 DNase 的活性。減少物理因素對(duì) DNA 的降解，物理降解因素主要包括機(jī)械剪切力 (如劇烈振蕩、攪拌等)，細(xì)胞突然置于低滲液中導(dǎo)致的細(xì)胞爆炸式破裂， DNase 大量釋放，樣品反復(fù)凍融和高溫等。4、DNA 洗脫收集DNA 的洗脫效率取決于以下重要因素：洗脫液成分：采用硅基質(zhì)膜吸附的 DNA，可將 DNA 在低鹽高 pH 值條件下洗脫下來。pH 值在 7.0-8.5 之間洗脫效率較高，pH 值低于

7、 7.0 則洗脫效率很低。一般基因組提取試劑盒中的洗脫緩沖液就是 TE(pH8.0) ，既為 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫下來提供良好的 pH 環(huán)境，其中的 EDTA 又能保證 DNA不被 DNase 降解，同時(shí)由于 EDTA 濃度非常低，對(duì)核酸內(nèi)切酶、DNA 聚合酶的影響非常微弱，不影響后續(xù)試驗(yàn)，可放心使用。洗脫液體積：當(dāng)洗脫液體積小于 30ul 時(shí)，洗脫效率很低且不穩(wěn)定；當(dāng)洗脫液體積在 50-200ul 時(shí)，洗脫效率穩(wěn)定在 80-90，并可保證得到最大產(chǎn)量， 因此洗脫液體積不能小于 30ul。加洗脫液部位：100-200ul 洗脫液能完全覆蓋硅基質(zhì)膜，DNA 的洗脫量可得到保證，但當(dāng)洗脫液體積

8、較少如 30-50ul 時(shí)，須在硅基質(zhì)膜中間部分懸空滴加 洗脫液，以確保少量的洗脫液能完全覆蓋硅膠膜。洗脫液的溫度：在加洗脫液之前，先將洗脫液在 60-75水浴中預(yù)熱 10 分鐘，可有 效提高 DNA 的洗脫效率。洗脫時(shí)間和次數(shù)：加入預(yù)熱的洗脫液后，可在室溫放置 2-5 分鐘使 DNA 完全溶解在洗脫液里通過離心而洗脫下來。同時(shí)可進(jìn)行二次或三次洗脫，即將前次洗脫下來的洗脫液再上柱、離心，使前次沒有洗脫下來的 DNA 再次溶解 在洗脫液里，從而提高 DNA 的產(chǎn)量。5、DNA 的定量及檢測提取得到的 DNA 片段需從分子質(zhì)量、濃度、純度等方面進(jìn)行檢測，從 而判斷 DNA 質(zhì)量。用瓊脂糖凝膠電泳分

9、析 DNA 分子質(zhì)量：得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。Solarbio 公司的基因組 DNA 提取試劑盒提取的不同材料基因組 DNA 片段大小一般在 50kb 左右，能很好地滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。通常用瓊脂糖凝膠電泳分析 DNA 分子質(zhì)量時(shí)，以溴酚藍(lán)為示蹤染料，EB 染色，紫外觀察，并與 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照即可判斷所提 DNA 的平均分子量。高質(zhì)量的基因組 DNA 應(yīng)顯示為單一條帶，如 DNA 降解則 表現(xiàn)為彌散條帶。用紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 濃度和純度：濃度測定：DNA 在 OD260 處有顯著吸收峰，OD260 值為 1 相當(dāng)于大約 50

10、ug/ml 雙 鏈 DNA。以下簡單介紹 OD260 的測定方法：所提基因組 DNA 樣品=100ul進(jìn)行 OD260 值測定的待測樣品 =20ul 所提基因組 DNA 樣品 +180ul TE=200ulDNA 稀釋倍數(shù)=200ul/20ul=10 倍如 200ul 待測樣品 OD260 值=0.2待測樣品濃度(即 100ul 基因組 DNA 樣品濃度)=50ug/ml×OD260 值× 稀釋倍數(shù)=100 ug/ml所提 100ul 基因組 DNA 樣品總量=100 ug/ml×100ul=10ug DNA 純度測定：一般用 OD260/OD280 值檢測 DN

11、A 樣品的純度。正常 OD260/OD280 值約為 1.7-1.9 ，說明 DNA 純度較好；若 OD260/OD280 值小于 1.7，說明可能有蛋白污染；若 OD260/OD280 值大于 2.0，說明可能有 RNA 污染 或 DNA 已經(jīng)降解。注：因?yàn)?pH 值和離子會(huì)影響光吸收值，因此洗脫時(shí)如不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，OD260/OD280 值會(huì)偏低，但并不表示純度低。6、DNA 的儲(chǔ)存儲(chǔ)存溶液：DNA 為兩性解離分子，在堿性條件下較穩(wěn)定，因此一般用 TE(pH8.0)保存。TE 的成分為：10 mM Tris-HCl(Tris 與鹽酸形成強(qiáng)的緩沖對(duì))；1 mM EDTA(乙二胺四乙酸，能螯合二價(jià)金屬陽離子，抑制 DNase 的活性)；pH8.0( 堿性條件可減少 DNA 的脫氨作用，防止降解)。ddH2O 的正常 pH 值為 7.0 ，可作為 DNA 的