人同型半胱氨酸ELISA試劑盒說明書

1、人同型半胱氨酸（Hey）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書廈門蔥嘉生物科技有限公司本試劑盒僅供研究使用檢測范圍： nmol/ml - 50 nmol/ml最低檢測限： nmol/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人Hey,且與其他相關(guān)蛋白無交 叉反應(yīng)。有效期：6個月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上淸或其它相關(guān)生物 液體中Hey含量。說明1. 試劑盒保存：-20£ （較長時間不用時）；2-8°C （頻繁使用時）。2. |X 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。4. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。5. 剛開啟的酶

2、聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實 驗結(jié)果造成任何影響。概述同型半胱氨酸Hey又稱髙半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，不屬于組成蛋 白質(zhì)的20種氨基酸，體內(nèi)不能合成，只能來源于蛋氨酸的分解代謝。Hey是 甲硫氨酸代謝形成的中間產(chǎn)物。，在體內(nèi)由甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成，有兩種途 徑。再甲基化途徑：約有50%Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下，以維生素B12為 輔因子，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體，發(fā)生再甲基化，重新合成蛋氨酸。 轉(zhuǎn)硫途徑：另外約50%的Hey經(jīng)轉(zhuǎn)硫途徑不可逆生成半胱氨酸和a酶丁酸， 此過程需維生素B6依賴的胱硫醯B合成酶和甲硫氨酸合成酶參與。Hey合成 和代謝途徑及其相關(guān)的

3、酶系統(tǒng)、葉酸、維生素B12和維生素B6的缺乏、MTHFR、 甲硫氨酸合成酶(MS)、CBS的缺陷都可引起高同型半胱氨酸血癥。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗Hey抗體的微孔中 依次加入標本或標準品、生物素化的抗Hey抗體、HR卩標記的親和素，經(jīng)過徹 底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的 作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Hey呈正相關(guān)。用酶標儀 在450nm波長下測定吸光度(0D值)，計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1. 酶聯(lián)板(Assay plate ):塊(96孔)。2. 標準品(Standard)：2瓶(凍干品)。3.

4、 樣品稀釋液(Sample Diluent):1 X20ml/瓶。4.5. 生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：1 X 10ml/瓶。6. 辣根過氯化物酶標記親和素稀釋液(HRP-avidin D訂uent)：IX 10ml/瓶。7. 生物素標記抗體(Biotin-antibody)：lX120ul/瓶(I：100)o& 辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin)：lX120ul/瓶(1：100)o9. 底物溶液(TMB Substrate)：IX 10ml/瓶。10. 濃洗滌液(Wash Buffer)： lX20nd/瓶，使用時每瓶用蒸鐳水

5、稀釋25 倍。11. 終止液(Stop Solution)：IX 10ml/瓶(2NH2S04)o需要而未提供的試劑和器材1. 標準規(guī)格酶標儀2. 髙速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管6. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸館水，容量瓶等標本的采集及保存1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4*過夜后于1000 x g離心20分 鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20£或-8(TC保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍 融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心1

6、5分鐘，或?qū)吮痉庞?2(TC或-8(TC保存，但應(yīng)避免反復(fù) 凍融。3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 xg離心20分鐘，取上清即可 檢測，或?qū)吮痉庞?2(rc或-8CTC保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。 標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。 只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應(yīng) 做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了 “N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N” o標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1H11,蓋好后 靜置10分鐘以上，然后反復(fù)

7、顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50 n mol/ml,做 系列倍比稀釋后，分別稀釋 50 nmol/ml, 25 nmol/ml, n mol/ml, n mol/ml, nmol/ml, nmol/ml, nmol/ml.,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 nmol/ml, 臨用前15分鐘內(nèi)配制。I如配制25 nmol/ml 1標準品：取(不要少于)50 nmol/ml的上述標準品加入 含樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所 需的總量配制(每孔lOOul),實際配制時應(yīng)多配制。如

8、10ul生物素標記抗體 加990ul生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi) 配制。辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的 每次實驗所需的總量配制（每孔lOOul）,實際配制時應(yīng)多配制。如10ul辣根 過氧化物酶標記親和素加990ul辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配 制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻 時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品 稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設(shè)

9、空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液lOOul, 余孔分別加標準品或待測樣品lOOul,注意不要有氣泡，加樣將樣品加于 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜， 37工反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100ul （取 lul生物素標記抗體加99ul生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混 勻，在使用前一小時內(nèi)配制），379,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘， 200ul/每孔，甩干。4. s 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素

10、工作液（同生物素標記抗體工作液） 100ul, 37°C, 60 分鐘。6. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘， 200ul/每孔，甩干。7. 依序每孔加底物溶液90ul, 37X2避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標 準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。& 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加 入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底 物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。9.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（0D值）。在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進行

11、檢測。實驗備注1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到 管底。2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶 液及2N H2S04o測量時先用此孔調(diào)0D值至零。3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上 蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8£保存。標準品、生物素標記抗體 工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請 勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物 酶標記親和素工作液。5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。洗板方法手

12、工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上 鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少注入孔 內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），0D值為縱坐標（普通坐標），在半對 數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的0D值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再 乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與0D值計算出標準曲線的直線回歸方程式, 將樣品的0D值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的 實際濃度。注意事項1. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。2. 洗滌過