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1、(ii)實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)含量測(cè)定法本實(shí)驗(yàn)的口的是學(xué)會(huì)各種蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。了解各種測(cè)定方法的基本原理和 優(yōu)缺點(diǎn)。蛋口質(zhì)含量測(cè)定法,是生物化學(xué)研究小最常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四種古老的經(jīng)典方法,即定氮法,雙縮尿法(biuret法)、folin酚試劑法(lowry 法)和紫外吸收法。另外還有一種近i年才普遍使用起來(lái)的新的測(cè)定法,即考馬斯亮藍(lán) 法(bradford法)。其'i' bradford法和lowry法靈敏度最高,比紫外吸收法靈敏1020 倍,比biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測(cè)定 的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)
2、準(zhǔn)蛋白質(zhì)。值得注意的是,這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋口質(zhì),因?yàn)?-種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定,有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完 美無(wú)缺的,都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法吋應(yīng)考慮:實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所耍求的靈敏度和精確 度;蛋口質(zhì)的性質(zhì);溶液小存在的t擾物質(zhì);測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間??捡R斯亮藍(lán)法(bnidford法),由于其突出的優(yōu)點(diǎn),正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化),氨乂與硫酸作用,變成硫 酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使z分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至酸液屮,根據(jù)此酸液被小和的程度 可計(jì)算得樣品z氮含量。若以廿氨酸為
3、例,其反應(yīng)式如下:ch2cooh|+3h2so4 -> 2co2 + 3so2 +4h2o +nh3 (1)nh22nh3 + h2so4 ->(nh4)2so4(2)(nh4)2so4 + 2naoh t 2h2o +na2so4 + 2nh3(3)反應(yīng)(1)、(2)在凱氏瓶?jī)?nèi)完成,反應(yīng)(3)在凱氏蒸餡裝置中進(jìn)行。為了加速消化,可以加入cuso4作催化劑,k2so4以提髙溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用 硼酸溶液,滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量,如欲求得樣品中蛋白含雖,應(yīng)將總氮雖減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋匚1質(zhì)的含量,即用樣品中蛋口氮乘以6.
4、25即得。五種蛋a質(zhì)測(cè)定方法比較如下:方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明凱氏定氮法(kjedahl 法)靈敏度低, 適用于0.2 l.omg 氮, 誤差為±2%費(fèi)時(shí)810小吋將蛋白氮轉(zhuǎn)化 為氨,用酸吸 收后滴定ib蛋白氮 (可用三氯 乙酸沉淀蛋 白質(zhì)而分 離)用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)含量的準(zhǔn)確 測(cè)定;干擾少; 費(fèi)吋太長(zhǎng)雙縮朋法(biuret 法)靈敏度低1 20mg屮速20-30分鐘多肽鍵+俶性+ t紫色絡(luò) 合物硫酸錢;tris緩沖液; 某些氨基酸用于快速測(cè) 定,但不太靈 敏;不同蛋白 質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏50loopg快速510分鐘蛋口質(zhì)中的酪 氨酸和色氨酸 殘基在280nm 處的光吸
5、收各種喋吟和各種核廿酸用于層析柱流 出液的檢測(cè);核酸的吸收可 以校正folin 酚試 劑法(lowry 法)靈敏度高5遽慢速40 60 分鐘雙縮豚反應(yīng); 磷釦酸一磷鈣 酸試劑被tyr 和phe還原硫酸條tris緩沖液; 甘氨酸; 各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng);操作要嚴(yán)格計(jì) 時(shí);顏色深淺隨不 同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍(lán) 法(bradford 法)靈敏度最高15曲快速515分鐘考馬斯亮藍(lán)染 料與蛋口質(zhì)結(jié) 合時(shí),其九max 由465nm變?yōu)?595nm強(qiáng)堿性緩沖 液;tritonx-100sds最好的方法; 干擾物質(zhì)少; 顏色穩(wěn)定; 顏色深淺隨不 同蛋白質(zhì)變化二、雙縮腺法(biuret法)(一)實(shí)驗(yàn)原理雙縮腺(n
6、h3conhconh3)是兩個(gè)分子脈經(jīng)180°c左右加熱,放出一個(gè)分子氨后得到 的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脈與cuso4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脈反應(yīng)。凡貝有 兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)玄接連接的肽鍵,或能過(guò)一個(gè)屮間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都 有雙縮騾反應(yīng)。o=c、hn r-cfl 0=th2quh2'0r-ch紫色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分了量及氨基酸成分無(wú) 關(guān),故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含最。測(cè)定范圍為1-lomg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要 有:硫酸鞍、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速,不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,以及干擾物質(zhì)少
7、。主 要的缺點(diǎn)是靈敏度羌。因此雙縮脈法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè) 定。(二)試劑與器材1. 試劑:(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)品牛血清清蛋口(bsa)或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白,配制成 10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,可用bsa濃度1 mg/ml的aggo為0.66來(lái)校正其純度。如有 需要,標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微最凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含最,計(jì)算出其純度,再根據(jù) 其純度,稱最配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用h2o或0.9%nacl配制,酪蛋白 用 0. 05n naoh k制。(2)雙縮豚試劑:稱以1.50克硫酸銅(cuso45出0)和6.0克酒石酸鉀鈉 (knac4h4o6 4h2o
8、),用500毫升水溶解,在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液,用水稀釋到1升,貯存于塑料瓶中(或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長(zhǎng)期保存。若 貯存瓶中有黑色沉淀岀現(xiàn),則需要重新配制。2. 器材:可見(jiàn)光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。(三)操作方法1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取12支試管分兩組,分別加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫 升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用水補(bǔ)足到1毫升,然后加入4亳升雙縮服試劑。充分搖勻后, 在室溫(2025°c)下放置30分鐘,于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的 第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值,以蛋白質(zhì)的含最為橫廉
9、標(biāo),光吸收 值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測(cè)定:取23個(gè)試管,用上述同樣的方法,測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。 注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。三、folin一酚試劑法(lowry法)(一)實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法,由于 一其試劑乙的配制較為困難(現(xiàn)在已可以訂購(gòu)),近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所収代。此 法的顯色原理與雙縮聯(lián)方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即folin-酚試劑,以 增加顯色最,從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是: 在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合牛成復(fù)合物。folin酚試劑中的磷如酸鹽 磷鴿酸
10、鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯內(nèi)氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉗蘭和錫蘭的混合 物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。folin酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的棊木步驟。以后在生物化學(xué) 領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,比雙縮腺法靈敏得多,缺點(diǎn)是費(fèi) 時(shí)間較長(zhǎng),要楮確控制操作時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干 擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮腺反應(yīng)發(fā)生十?dāng)_的離了,同樣容易干擾lowry m應(yīng)。而r對(duì)后者的 彩響還要人得多。酚類、檸檬酸、硫酸讓、tris緩沖液、甘氨酸、糊類、甘汕等均有干 擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),俏酸納(1%),三氯乙酸(
11、0.5%), 乙醇(5%),乙瞇(5%),丙酮(0.5%)等溶液対顯色無(wú)影響,但這些物質(zhì)濃度高時(shí), 必須作校正曲線。含硫酸錢的溶液,只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液,即可顯色測(cè)定。 若樣品酸度較高,顯色后會(huì)色淺,則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí),加f olin-酚試劑時(shí)要特別小心,因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性ph條件下穩(wěn) 定,但上述還原反應(yīng)只在ph=10的情況下發(fā)生,故當(dāng)folin -酚試劑加到堿性的銅一蛋 白質(zhì)溶液中時(shí),必須立即混勻,以便在磷如酸一磷鴨酸試劑被破壞之前,還原反應(yīng)即 能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5gg0通常測(cè)定范圍是20250
12、曲。(二)試劑與器材1. 試劑(1)試劑甲:(a)10 克 na2co3, 2 克 naoh 和 0.25 克灑石酸鉀鈉(knac4h4o6 4h2o)。 溶解于500毫升蒸憎水屮。(b)0.5克硫酸銅(cuso4 - 5h2o)溶解于100毫升蒸館水中,每次使用前,將 50份(a)與1份(b)混合,即為試劑甲。(2)試劑乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克鉤酸鈉(na2wo42比0) ,25克鉗酸鈉 (na2moo4 - 2h2o )及700毫升蒸側(cè)水,再加50毫升85%磷酸,100毫升濃鹽酸,充 分混合,接上回流管,以小火回流10小時(shí),回流結(jié)束時(shí),加入150克硫酸 鋰(li2so4), 5
13、0亳升蒸憎水及數(shù)滴液體漠,開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘,以便驅(qū)除過(guò)最的漠。冷卻后溶液 呈黃色(如仍呈綠色,須再重復(fù)滴加液體漠的步驟)。稀釋至1升,過(guò)濾,濾液置于棕 色試劑瓶屮保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定,酚猷作指示劑,然后適當(dāng)稀釋,約加水1 倍,使最終的酸濃度為1n左右。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱収結(jié)品牛血清清蛋白或 l球蛋白,溶于蒸憎水,濃度為250 ng/ml左右。 牛血清清蛋白溶于水若混濁,可改用0.9 % nacl溶液。2. 器材(1)nj*見(jiàn)光分光光度計(jì)(2)旋渦混合器(3)秒表(4)試管16支(三)操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取16支大試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分
14、成兩組,分別加入0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度為250pg/ml)。 用水補(bǔ)足到1.0毫升,然后每支試管加入5亳升試劑甲,在旋渦混合器上迅速混合,于 室溫(2025°c)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(folin酚試劑),同樣立 即混勻。這一步混合速度要快,否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘, 以未加蛋白質(zhì)溶液的笫一支試管作為空白對(duì)照,于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度 值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo),吸光度值為縱座標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意:因lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深,因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間,即
15、 笫1支試管加入5毫升試劑甲后,開(kāi)始計(jì)時(shí),1分鐘后,笫2支試管加入5亳升試劑甲, 2分鐘后加第3支試管,余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘,則笫1 支試管可立即加入0.5亳升試劑乙,1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙,2分鐘后 加笫3支試管,余此類推。待最后一支試管加完試劑后,再放置30分鐘,然后開(kāi)始測(cè) 定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí),為了防止出錯(cuò),每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄木上預(yù)先畫好下面 的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量(亳升),并按由左至右,山上至下的順序,逐管加入。最下血兩排是計(jì)算出的每管中蛋匚i質(zhì)的量(微克)和測(cè)得的吸光度值。folin酚試劑法實(shí)驗(yàn)表格:管
16、號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋片質(zhì)0()0.20.40.6().81.()(250|ig/ml)未知蛋口質(zhì)0.20.40.6(約 250tg/ml)蒸懈水1.()0.9().80.60.40.20().80.60.4試劑甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0試劑乙0.50.50.50.5().50.50.50.5().50.5每管中蛋口質(zhì) 的量(pg) 吸光度值(a700)2. 樣品的測(cè)定:取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質(zhì)20-250微克),按上述方法 進(jìn)行操作,取1毫升蒸鎘水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的 測(cè)定放在一起,同吋進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
17、的各試管后而,再增加3個(gè)試管。如上表 中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上杳岀相應(yīng)的蛋片質(zhì)量,從而計(jì)算出樣品溶 液的蛋口質(zhì)濃度。注意,山于各種蛋口質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,顯色的深淺往往隨不同的 蛋白質(zhì)而變化。因而木測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度(相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì))。四、改良的簡(jiǎn)易folin-酚試劑法(一)試劑1. 試劑甲:堿性銅試劑溶液中,含0.5n naoh、10%na2co3 0.1%酒石酸鉀和0.05% 硫酸銅,配制吋注意硫酸銅用少量蒸係水溶解后,最后加入。2. 試劑乙:與前面的基木法札i同。臨用時(shí)加蒸餡水稀禪8倍。3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:同基本法。
18、(-)操作步驟測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基木法札i同。只是試劑甲改為1毫升,室溫 放置1()分鐘示,試劑乙改為4毫升。在55°ctu溫水浴屮保溫5分鐘。用流動(dòng)水冷卻后, 在660nm卜測(cè)定其吸光度值。改良的快速簡(jiǎn)易法,可獲得與folin-酚試劑法(即lowry基本法)相接近的結(jié)杲。五、考馬斯亮蘭法(bradford法)(一)實(shí)驗(yàn)原理雙縮腺法(biuret法)和folin酚試劑法(lowry法)的明顯缺點(diǎn)和許多限制,促 使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測(cè)定的方法。1976年山bradford建立的考馬斯亮蘭法(bradford法),是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié) 合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋
19、白質(zhì)測(cè)定法具啟超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn),因而正在得到 廣泛的應(yīng)用。這一方法是1=1前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法??捡R斯亮蘭g-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的最大吸收峰的位置 (xmax),由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)硏究認(rèn)為,染料 主要是與蛋白質(zhì)屮的堿性氨基酸(特別是精氮酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值a595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。b radford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:(1)靈敏度高,據(jù)估計(jì)比lowry法約高四倍,其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1 pg。這是 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)牛的顏色變化很大,蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物有更高的消光系
20、 數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比lowry法要人的多。(2)測(cè)定快速、簡(jiǎn)便,只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定,只需要5分鐘左右。 山于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持 穩(wěn)定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像lowry法那樣 費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。(3)干擾物質(zhì)少。如t擾lowry法的kj na mg?犒子、tris緩沖液、糖和廉糖、 甘汕、筑基乙醉、edta等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是:(1)iii于各種蛋口質(zhì)中的楷氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford 用于 不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)冇較人的偏差,在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲
21、線時(shí)通常選用丫一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì),以減少這方面的偏差。(2)仍有一些物質(zhì)t擾此法的測(cè)定,主要的t擾物質(zhì)有:去污劑、triton x-100. 十二烷基硫酸鈉(sds)和0n的naoh。(如同0.in的酸干擾lowary法一樣)。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性,因而不能用beer定律進(jìn)行計(jì)算,而只能用標(biāo)準(zhǔn) 曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。(二)試劑與器材1. 試劑:(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用丫一球蛋白或牛血清清蛋白(bsa),配制成和 0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。(2)考馬斯亮蘭g250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭g250,溶于50ml 95% 的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,
22、用水稀釋至1升。2. 器材:(1)可見(jiàn)光分光光度計(jì)(2)旋渦混合器(3)試管16支(三)操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)方法(1)取16支試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分為兩組按表中順序, 分別加入樣品、水和試劑,即用1 .omg/m 1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入:0、0.01、 0.02、0.04、0.06、0.08、oml,然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入 5.0ml考馬斯亮蘭g-250試劑,每加完一管,立即在旋渦混合器上混合(注意不耍太劇 烈,以免產(chǎn)生人最氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見(jiàn)下表中的第8、9、10管。(2)加完試劑25分鐘后,即可開(kāi)始用比色皿,在
23、分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm 處的光吸收值a595,空白對(duì)照為第1號(hào)試管,即0.1mlh2o加5.0mlg250試劑。注意:不可使用石英比色血(因不易洗去染色),可用冊(cè)料或玻璃比色皿,使用后 立即用少量95%的乙醇蕩洗,以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡??捡R斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表格:管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.010.020.040.060.08().1()(l.()mg/ml)未知蛋口質(zhì)0.020.040.06(約 1 .omg/ml)蒸鐳水()0.09().080.060.040.0200.080.06().04考馬斯亮藍(lán)g-250 試劑 5.()5.()5.
24、05.()5.()5.()5.()5.05.()5.()每管屮的蛋 白質(zhì)最(pg) 光吸收值(a595)(3)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(曲)為橫座標(biāo),用吸光度值a595為縱座標(biāo),作圖,即得到 一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)測(cè)出的未知樣品的a595值,即可查出未知樣品的蛋 白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50o2. 微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)(10100|ig/ml),可將取樣最(包括補(bǔ)加的水)加大到 0.5ml或1.0ml,空白対照則分別為0.5ml或1.0ml h2o,考馬斯亮藍(lán)g-250試劑仍加 5.0ml,同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定595nm的光吸收值。0.05mg
25、牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子屮,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含啟共軌雙鍵,使蛋白質(zhì)具 有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成 正比。此外,蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下,蛋 白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速,不消耗樣品,測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽, 例如生化制備中常用的(nhj 2so4等和大多數(shù)緩沖液不t擾測(cè)定。特別適用于柱層析 洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè),因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其絕對(duì)值。此
26、法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含最的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)多,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋 白質(zhì)含量時(shí),対那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差界大的蛋白質(zhì),有一定的誤 差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含伸票吟、唬 i癥及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會(huì)出現(xiàn)較人的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表,再 進(jìn)行計(jì)算的方法,加以適當(dāng)?shù)男U5且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不和同 的,雖然經(jīng)過(guò)校正,測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的謀差。此外,進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ph的改變而有變化,因 此要注意溶液的ph值,測(cè)定樣品時(shí)的ph要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的ph相-致。下面介紹四種紫外吸收法:
27、1. 280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收,且各種蛋 白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大,因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最 常用的紫外吸收法。測(cè)定時(shí),將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑(水或緩 沖液)作空白對(duì)照,在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280o蛋白質(zhì)濃度可 控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色111l,盛有濃度為lmg/ml的 蛋白質(zhì)溶液時(shí),a280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查,根據(jù)
28、此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與(acq值(即 蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1cm時(shí)的光吸收值)的關(guān)系。文獻(xiàn)值a1%lcm,x稱為百分 吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度=(a280x 10)/a1 1 icm.280nm (mg/ml) (v1% 濃度 «10mg/ml)例:牛血清清蛋白:a,%lcm=6.3 (280nm)溶菌酶:a,%lcm=22.8 (280nm)若查不到待測(cè)蛋白質(zhì)的a,%lcm值,則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含 量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋口質(zhì)溶液配制的濃度 為1.0mg/mlo常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋
29、白質(zhì)為牛血清清蛋白(bsa)o標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取6支試管,按下表編號(hào)并加入試劑:管號(hào)123456bsa (1 .omg/ml)01.02.03.04.05.0h2o5.04.03.02.01.00a28o用第1管為空口對(duì)照,各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度a28(),以 a?*。為縱座標(biāo),各管的蛋口質(zhì)濃度或蛋口質(zhì)量(噸)為橫座標(biāo)作圖,標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線, 利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)測(cè)出的未知樣品的a?*。值,即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量,也 可以用2至6管a?*)俏與相應(yīng)的試管中的蛋口質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋111質(zhì)的al%lcm,28()nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸對(duì)紫外光冇很強(qiáng)的吸收,在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍(每克),但核酸 在260nm處的吸收更強(qiáng),其吸收髙峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm 處的2倍,而蛋111質(zhì)則相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常:純蛋白質(zhì)的光吸收比值:a280/a260« 1.8純核酸的光吸收比值:a28o/a26o«o.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液,可分別測(cè)定其a?*。和a260, iii此吸收差值,用下而的經(jīng)驗(yàn) 公式
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