實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1、(ii)實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)含量測(cè)定法本實(shí)驗(yàn)的口的是學(xué)會(huì)各種蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。了解各種測(cè)定方法的基本原理和 優(yōu)缺點(diǎn)。蛋口質(zhì)含量測(cè)定法，是生物化學(xué)研究小最常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法(biuret法)、folin酚試劑法(lowry 法)和紫外吸收法。另外還有一種近i年才普遍使用起來(lái)的新的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán) 法(bradford法)。其'i' bradford法和lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020 倍，比biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定 的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)

2、準(zhǔn)蛋白質(zhì)。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋口質(zhì)，因?yàn)?-種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完 美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法吋應(yīng)考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所耍求的靈敏度和精確 度；蛋口質(zhì)的性質(zhì)；溶液小存在的t擾物質(zhì)；測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間?？捡R斯亮藍(lán)法(bnidford法)，由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨乂與硫酸作用，變成硫 酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使z分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液屮，根據(jù)此酸液被小和的程度 可計(jì)算得樣品z氮含量。若以廿氨酸為

3、例，其反應(yīng)式如下：ch2cooh|+3h2so4 -> 2co2 + 3so2 +4h2o +nh3 (1)nh22nh3 + h2so4 ->(nh4)2so4(2)(nh4)2so4 + 2naoh t 2h2o +na2so4 + 2nh3(3)反應(yīng)(1)、(2)在凱氏瓶?jī)?nèi)完成,反應(yīng)(3)在凱氏蒸餡裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入cuso4作催化劑，k2so4以提髙溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用 硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含雖，應(yīng)將總氮雖減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋匚1質(zhì)的含量，即用樣品中蛋口氮乘以6.

4、25即得。五種蛋a質(zhì)測(cè)定方法比較如下:方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明凱氏定氮法（kjedahl 法）靈敏度低， 適用于0.2 l.omg 氮， 誤差為±2%費(fèi)時(shí)810小吋將蛋白氮轉(zhuǎn)化 為氨，用酸吸 收后滴定ib蛋白氮 （可用三氯 乙酸沉淀蛋 白質(zhì)而分 離）用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)含量的準(zhǔn)確 測(cè)定；干擾少； 費(fèi)吋太長(zhǎng)雙縮朋法（biuret 法）靈敏度低1 20mg屮速20-30分鐘多肽鍵+俶性+ t紫色絡(luò) 合物硫酸錢；tris緩沖液； 某些氨基酸用于快速測(cè) 定，但不太靈 敏；不同蛋白 質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏50loopg快速510分鐘蛋口質(zhì)中的酪 氨酸和色氨酸 殘基在280nm 處的光吸

5、收各種喋吟和各種核廿酸用于層析柱流 出液的檢測(cè);核酸的吸收可 以校正folin 酚試 劑法（lowry 法）靈敏度高5遽慢速40 60 分鐘雙縮豚反應(yīng)； 磷釦酸一磷鈣 酸試劑被tyr 和phe還原硫酸條tris緩沖液； 甘氨酸； 各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì) 時(shí)；顏色深淺隨不 同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍(lán) 法（bradford 法）靈敏度最高15曲快速515分鐘考馬斯亮藍(lán)染 料與蛋口質(zhì)結(jié) 合時(shí)，其九max 由465nm變?yōu)?595nm強(qiáng)堿性緩沖 液；tritonx-100sds最好的方法； 干擾物質(zhì)少； 顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不 同蛋白質(zhì)變化二、雙縮腺法（biuret法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮腺（n

6、h3conhconh3）是兩個(gè)分子脈經(jīng)180°c左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到 的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脈與cuso4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脈反應(yīng)。凡貝有 兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)玄接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)屮間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都 有雙縮騾反應(yīng)。o=c、hn r-cfl 0=th2quh2'0r-ch紫色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分了量及氨基酸成分無(wú) 關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含最。測(cè)定范圍為1-lomg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要 有：硫酸鞍、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少

7、。主 要的缺點(diǎn)是靈敏度羌。因此雙縮脈法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè) 定。（二）試劑與器材1. 試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)品牛血清清蛋口（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成 10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用bsa濃度1 mg/ml的aggo為0.66來(lái)校正其純度。如有 需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微最凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含最，計(jì)算出其純度，再根據(jù) 其純度，稱最配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用h2o或0.9%nacl配制，酪蛋白 用 0. 05n naoh k制。（2）雙縮豚試劑：稱以1.50克硫酸銅（cuso45出0）和6.0克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6 4h2o

8、）,用500毫升水溶解,在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液,用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若 貯存瓶中有黑色沉淀岀現(xiàn)，則需要重新配制。2. 器材：可見(jiàn)光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。（三）操作方法1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取12支試管分兩組,分別加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫 升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4亳升雙縮服試劑。充分搖勻后， 在室溫（2025°c）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的 第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含最為橫廉

9、標(biāo)，光吸收 值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測(cè)定：取23個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。 注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。三、folin一酚試劑法（lowry法）（一）實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于 一其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所収代。此 法的顯色原理與雙縮聯(lián)方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin-酚試劑，以 增加顯色最，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是： 在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合牛成復(fù)合物。folin酚試劑中的磷如酸鹽 磷鴿酸

10、鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯內(nèi)氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉗蘭和錫蘭的混合 物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。folin酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的棊木步驟。以后在生物化學(xué) 領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮腺法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi) 時(shí)間較長(zhǎng)，要楮確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干 擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮腺反應(yīng)發(fā)生十?dāng)_的離了，同樣容易干擾lowry m應(yīng)。而r對(duì)后者的 彩響還要人得多。酚類、檸檬酸、硫酸讓、tris緩沖液、甘氨酸、糊類、甘汕等均有干 擾作用。濃度較低的尿素（0.5%）,硫酸納（1%）,俏酸納（1%）,三氯乙酸（

11、0.5%）, 乙醇（5%）,乙瞇（5%）,丙酮（0.5%）等溶液対顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)， 必須作校正曲線。含硫酸錢的溶液，只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。 若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加f olin-酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性ph條件下穩(wěn) 定，但上述還原反應(yīng)只在ph=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin -酚試劑加到堿性的銅一蛋 白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷如酸一磷鴨酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即 能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5gg0通常測(cè)定范圍是20250

12、曲。（二）試劑與器材1. 試劑（1）試劑甲：（a）10 克 na2co3, 2 克 naoh 和 0.25 克灑石酸鉀鈉（knac4h4o6 4h2o）。 溶解于500毫升蒸憎水屮。（b）0.5克硫酸銅（cuso4 - 5h2o）溶解于100毫升蒸館水中,每次使用前,將 50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。（2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鉤酸鈉（na2wo42比0） ,25克鉗酸鈉 （na2moo4 - 2h2o ）及700毫升蒸側(cè)水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充 分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸 鋰（li2so4）, 5

13、0亳升蒸憎水及數(shù)滴液體漠，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)最的漠。冷卻后溶液 呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體漠的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕 色試劑瓶屮保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定，酚猷作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1 倍，使最終的酸濃度為1n左右。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱収結(jié)品牛血清清蛋白或 l球蛋白，溶于蒸憎水，濃度為250 ng/ml左右。 牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % nacl溶液。2. 器材（1）nj*見(jiàn)光分光光度計(jì)（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支（三）操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分

14、成兩組，分別加入0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250pg/ml）。 用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5亳升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于 室溫（2025°c）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin酚試劑），同樣立 即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘， 以未加蛋白質(zhì)溶液的笫一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度 值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即

15、 笫1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，笫2支試管加入5亳升試劑甲, 2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則笫1 支試管可立即加入0.5亳升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后 加笫3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè) 定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄木上預(yù)先畫好下面 的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（亳升），并按由左至右，山上至下的順序，逐管加入。最下血兩排是計(jì)算出的每管中蛋匚i質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。folin酚試劑法實(shí)驗(yàn)表格:管

16、號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋片質(zhì)0()0.20.40.6().81.()(250|ig/ml)未知蛋口質(zhì)0.20.40.6(約 250tg/ml)蒸懈水1.()0.9().80.60.40.20().80.60.4試劑甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0試劑乙0.50.50.50.5().50.50.50.5().50.5每管中蛋口質(zhì) 的量（pg） 吸光度值（a700）2. 樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20-250微克），按上述方法 進(jìn)行操作，取1毫升蒸鎘水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的 測(cè)定放在一起，同吋進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

17、的各試管后而，再增加3個(gè)試管。如上表 中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上杳岀相應(yīng)的蛋片質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶 液的蛋口質(zhì)濃度。注意，山于各種蛋口質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的 蛋白質(zhì)而變化。因而木測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)）。四、改良的簡(jiǎn)易folin-酚試劑法（一）試劑1. 試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5n naoh、10%na2co3 0.1%酒石酸鉀和0.05% 硫酸銅，配制吋注意硫酸銅用少量蒸係水溶解后，最后加入。2. 試劑乙：與前面的基木法札i同。臨用時(shí)加蒸餡水稀禪8倍。3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。

18、（-）操作步驟測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基木法札i同。只是試劑甲改為1毫升，室溫 放置1（）分鐘示，試劑乙改為4毫升。在55°ctu溫水浴屮保溫5分鐘。用流動(dòng)水冷卻后, 在660nm卜測(cè)定其吸光度值。改良的快速簡(jiǎn)易法，可獲得與folin-酚試劑法（即lowry基本法）相接近的結(jié)杲。五、考馬斯亮蘭法（bradford法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮腺法（biuret法）和folin酚試劑法（lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促 使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測(cè)定的方法。1976年山bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié) 合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋

19、白質(zhì)測(cè)定法具啟超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到 廣泛的應(yīng)用。這一方法是1=1前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法?？捡R斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置 （xmax）,由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)硏究認(rèn)為，染料 主要是與蛋白質(zhì)屮的堿性氨基酸（特別是精氮酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值a595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。b radford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1 pg。這是 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)牛的顏色變化很大，蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物有更高的消光系

20、 數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比lowry法要人的多。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。 山于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持 穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像lowry法那樣 費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如t擾lowry法的kj na mg?犒子、tris緩沖液、糖和廉糖、 甘汕、筑基乙醉、edta等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：（1）iii于各種蛋口質(zhì)中的楷氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford 用于 不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)冇較人的偏差，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲

21、線時(shí)通常選用丫一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)t擾此法的測(cè)定，主要的t擾物質(zhì)有：去污劑、triton x-100. 十二烷基硫酸鈉（sds）和0n的naoh。（如同0.in的酸干擾lowary法一樣）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn) 曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。（二）試劑與器材1. 試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用丫一球蛋白或牛血清清蛋白（bsa）,配制成和 0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮蘭g250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g250,溶于50ml 95% 的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，

22、用水稀釋至1升。2. 器材：（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)（2）旋渦混合器（3）試管16支（三）操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)方法（1）取16支試管，1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分為兩組按表中順序, 分別加入樣品、水和試劑，即用1 .omg/m 1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、 0.02、0.04、0.06、0.08、oml,然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入 5.0ml考馬斯亮蘭g-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不耍太劇 烈，以免產(chǎn)生人最氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見(jiàn)下表中的第8、9、10管。（2）加完試劑25分鐘后，即可開(kāi)始用比色皿，在

23、分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm 處的光吸收值a595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlh2o加5.0mlg250試劑。注意：不可使用石英比色血（因不易洗去染色），可用冊(cè)料或玻璃比色皿，使用后 立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡?？捡R斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表格:管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.010.020.040.060.08().1()(l.()mg/ml)未知蛋口質(zhì)0.020.040.06(約 1 .omg/ml)蒸鐳水()0.09().080.060.040.0200.080.06().04考馬斯亮藍(lán)g-250 試劑 5.()5.()5.

24、05.()5.()5.()5.()5.05.()5.()每管屮的蛋 白質(zhì)最（pg） 光吸收值（a595）（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（曲）為橫座標(biāo)，用吸光度值a595為縱座標(biāo)，作圖，即得到 一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋 白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50o2. 微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10100|ig/ml）,可將取樣最（包括補(bǔ)加的水）加大到 0.5ml或1.0ml,空白対照則分別為0.5ml或1.0ml h2o,考馬斯亮藍(lán)g-250試劑仍加 5.0ml,同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定595nm的光吸收值。0.05mg

25、牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子屮，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含啟共軌雙鍵，使蛋白質(zhì)具 有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成 正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋 白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽， 例如生化制備中常用的（nhj 2so4等和大多數(shù)緩沖液不t擾測(cè)定。特別適用于柱層析 洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。此

26、法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含最的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋 白質(zhì)含量時(shí)，対那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差界大的蛋白質(zhì)，有一定的誤 差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含伸票吟、唬 i癥及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較人的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再 進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不和同 的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的謀差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ph的改變而有變化，因 此要注意溶液的ph值，測(cè)定樣品時(shí)的ph要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的ph相-致。下面介紹四種紫外吸收法：

27、1. 280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋 白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最 常用的紫外吸收法。測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩 沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280o蛋白質(zhì)濃度可 控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色111l,盛有濃度為lmg/ml的 蛋白質(zhì)溶液時(shí)，a280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)

28、此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（acq值（即 蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值a1%lcm,x稱為百分 吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度=(a280x 10)/a1 1 icm.280nm (mg/ml) (v1% 濃度 «10mg/ml)例：牛血清清蛋白：a,%lcm=6.3 (280nm)溶菌酶：a,%lcm=22.8 (280nm)若查不到待測(cè)蛋白質(zhì)的a,%lcm值，則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含 量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋口質(zhì)溶液配制的濃度 為1.0mg/mlo常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋

29、白質(zhì)為牛血清清蛋白(bsa)o標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取6支試管，按下表編號(hào)并加入試劑：管號(hào)123456bsa (1 .omg/ml)01.02.03.04.05.0h2o5.04.03.02.01.00a28o用第1管為空口對(duì)照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度a28(),以 a?*。為縱座標(biāo)，各管的蛋口質(zhì)濃度或蛋口質(zhì)量(噸)為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線, 利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的a?*。值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也 可以用2至6管a?*)俏與相應(yīng)的試管中的蛋口質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋111質(zhì)的al%lcm,28()nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸對(duì)紫外光冇很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍(每克)，但核酸 在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收髙峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm 處的2倍，而蛋111質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：a280/a260« 1.8純核酸的光吸收比值：a28o/a26o«o.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其a?*。和a260, iii此吸收差值，用下而的經(jīng)驗(yàn) 公式