j目的基因的表達(dá)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1j目的基因目的基因(jyn)的表達(dá)的表達(dá)第一頁(yè)，共169頁(yè)。第1頁(yè)/共168頁(yè)第二頁(yè)，共169頁(yè)。遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞(chund)過(guò)程中心法則（central dogma）。 第2頁(yè)/共168頁(yè)第三頁(yè)，共169頁(yè)。外源基因(jyn)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因(jyn)表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。第3頁(yè)/共168頁(yè)第四頁(yè)，共169頁(yè)。用原核生物(shngw)作宿主A dividing E. coli原核(yun h)或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列終止子第4頁(yè)/共168頁(yè)第五頁(yè)，共169頁(yè)。識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所

2、有(suyu)的RNA合成。數(shù)個(gè)相關(guān)(xinggun)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個(gè)表達(dá)的協(xié)同單位。2. 以操縱子為單位1. 只有一種RNA聚合酶第5頁(yè)/共168頁(yè)第六頁(yè)，共169頁(yè)。53轉(zhuǎn)錄(zhun l)mRNA53翻譯(fny)蛋白質(zhì)NC53第6頁(yè)/共168頁(yè)第七頁(yè)，共169頁(yè)。第7頁(yè)/共168頁(yè)第八頁(yè)，共169頁(yè)。4. 不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工(ji gng)系統(tǒng)。5. 調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄(zhun l)水平上。 含有一個(gè)(y )啟始密碼子和一段同核糖體16SrRNA3末端堿基互補(bǔ)的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6. mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)第8頁(yè)/共168頁(yè)第

3、九頁(yè)，共169頁(yè)。外源基因(jyn)不能帶有內(nèi)含子。2. 必須(bx)用cDNA3. 不能直接用真核基因組DNA。4. 必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動(dòng)子等）5. 防止外源基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害。第9頁(yè)/共168頁(yè)第十頁(yè)，共169頁(yè)。是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成(hchng)的序列。大腸桿菌的所有(suyu)啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。1. 啟動(dòng)子-35 Box 和 -10 Box（1） 啟動(dòng)子序列 第10頁(yè)/共168頁(yè)第十一頁(yè)，共169頁(yè)。第11頁(yè)/共168頁(yè)第十二頁(yè)，共169頁(yè)。5-TTGACA-35-TATAAT-3 -10

4、box（Pribnow Box）TTGACATATAAT轉(zhuǎn)錄(zhun l)起始位點(diǎn)17bp5核糖體結(jié)合(jih)位點(diǎn)RNA聚合酶 亞基的識(shí)別(shbi)位點(diǎn) 。第12頁(yè)/共168頁(yè)第十三頁(yè)，共169頁(yè)。第13頁(yè)/共168頁(yè)第十四頁(yè)，共169頁(yè)。核糖體結(jié)合(jih)位點(diǎn)（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合(jih)的序列。ribosome binding sitemRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-D序列距離AUG的距離也影響翻譯第14頁(yè)/共168頁(yè)第十五頁(yè)，共169頁(yè)。AUG（91%）GUG

5、（8%）UUG（1%）位于SD序列(xli)下游。第15頁(yè)/共168頁(yè)第十六頁(yè)，共169頁(yè)。內(nèi)終止子intrinsic terminator：中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱(chēng)為(chn wi)內(nèi)終止子，形成終止信號(hào)。在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)(shj)一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子操縱子S-D序列目的基因終止子第16頁(yè)/共168頁(yè)第十七頁(yè)，共169頁(yè)。由于(yuy)莖環(huán)3段緊接一串A/U的配對(duì)，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。 反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對(duì)的堿基數(shù)降低，整個(gè)(zhngg)減弱了RNA 與DNA的

6、互作 莖環(huán)結(jié)構(gòu) 多聚A/U第17頁(yè)/共168頁(yè)第十八頁(yè)，共169頁(yè)。5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板(mbn)轉(zhuǎn)錄(zhun l)5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊(zhdi)mRNA折疊U CCU GGCAUCGCGGCCGCGGCA ACCCAC UUUU3DNARNA聚合酶脫落第18頁(yè)/共168頁(yè)第十九頁(yè)，共169頁(yè)。第19頁(yè)/共168頁(yè)第二十頁(yè)，共169頁(yè)。

7、大腸桿菌偏愛(ài)UAA。一般安置上全部的三個(gè)終止密碼(m m)防止核糖體跳躍（skipping）。Translation enhancer能夠顯著增強(qiáng)(zngqing)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡(jiǎn)稱(chēng)g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的區(qū)段。21第20頁(yè)/共168頁(yè)第二十一頁(yè)，共169頁(yè)。 必須(bx)是一種強(qiáng)啟動(dòng)子能使外源基因(jyn)的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上。應(yīng)是可誘導(dǎo)型的用溫度(wnd)或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。第21頁(yè)/共168頁(yè)第二十二頁(yè)，共169頁(yè)。來(lái)自大腸桿菌(d chn n jn)的乳糖操縱子。用

8、乳糖或其類(lèi)似物IPTG充當(dāng)誘導(dǎo)(yudo)物，與阻遏蛋白結(jié)合，解除抑制。PlacO目的(md)基因第22頁(yè)/共168頁(yè)第二十三頁(yè)，共169頁(yè)。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏(z )蛋白基因；P1P2啟動(dòng)子；O操縱基因；衰減(shui jin)子來(lái)自(li z)大腸桿菌的色氨酸操縱子。第23頁(yè)/共168頁(yè)第二十四頁(yè)，共169頁(yè)。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA鄰氨基(nj)苯甲酸合成酶吲哚甘油(n yu)硼酸合成酶色氨酸合成酶鏈鏈分支(fnzh)酸鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物轉(zhuǎn)錄（P1是主要

9、啟動(dòng)子，P2的作用只有3%。）沒(méi)有色氨酸時(shí)，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。第24頁(yè)/共168頁(yè)第二十五頁(yè)，共169頁(yè)。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸結(jié)合(jih)不轉(zhuǎn)錄(zhun l)用于表達(dá)載體的trp啟動(dòng)(qdng)子一般只包含啟動(dòng)(qdng)基因、操縱基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸時(shí)，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與操縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類(lèi)的轉(zhuǎn)錄（稱(chēng)為corepressor）。第25頁(yè)/共168頁(yè)第二十六頁(yè)，共169頁(yè)。第26頁(yè)/共168頁(yè)第二十七頁(yè)，共169頁(yè)。第27頁(yè)/共168頁(yè)第二十

10、八頁(yè)，共169頁(yè)。1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(biod)（1）包涵(bo hn)體（inclusion body） P93是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。形成原理未知。第28頁(yè)/共168頁(yè)第二十九頁(yè)，共169頁(yè)。例：使重組蛋白易于(yy)分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收(hushu)的蛋白生物活性差。 缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)第29頁(yè)/共168頁(yè)第三十頁(yè)，共169頁(yè)。（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌(d chn n jn)位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)的復(fù)雜機(jī)理目前(mqin)不完全清楚優(yōu)點(diǎn)：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的

11、少。第30頁(yè)/共168頁(yè)第三十一頁(yè)，共169頁(yè)。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等大腸桿菌(d chn n jn)的信號(hào)肽：能帶領(lǐng)蛋白(dnbi)穿過(guò)膜到達(dá)周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。（2）信號(hào)肽（signal peptide）第31頁(yè)/共168頁(yè)第三十二頁(yè)，共169頁(yè)。鼠源RNase、人生長(zhǎng)激素(shn chn j s)信號(hào)肽。也能在細(xì)菌(xjn)中起作用。胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白(dnbi)。金黃色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶 （endoglucanase）。第32頁(yè)

12、/共168頁(yè)第三十三頁(yè)，共169頁(yè)。由于需要穿過(guò)兩層膜，大腸桿菌(d chn n jn)只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血(rn xu)素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白(dnbi)分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中?；蚺c細(xì)菌素釋放蛋白（bacteriocin release protein)共表達(dá)。第33頁(yè)/共168頁(yè)第三十四頁(yè)，共169頁(yè)。第34頁(yè)/共168頁(yè)第三十五頁(yè)，共169頁(yè)。載體(zit)表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列(xli)ATG-外源基因(jyn)-TAG優(yōu)點(diǎn)1. 非融合型表達(dá)載體產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

13、接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。第35頁(yè)/共168頁(yè)第三十六頁(yè)，共169頁(yè)。哈佛大學(xué)(h f d xu)的Gilbert實(shí)驗(yàn)室建立的。表達(dá)能力強(qiáng)。組成(z chn)結(jié)構(gòu)： 強(qiáng)啟動(dòng)子: tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)lac操縱基因操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。第36頁(yè)/共168頁(yè)第三十七頁(yè)，共169頁(yè)。終止子：調(diào)節(jié)(tioji)基因：Lac I宿主菌染色體上的乳糖(r tn)操縱子系統(tǒng)。 如JM105菌。rrnB的強(qiáng)終止子rrnB強(qiáng)終止子S-D插入(ch r)位點(diǎn)區(qū)S-D序列和插入位點(diǎn)區(qū)：第37頁(yè)/共168頁(yè)第三十八頁(yè)，共169頁(yè)。

14、tac PLac OS-D插入(ch r)位點(diǎn)區(qū)rrnB T宿主(szh)lac I載體(zit)的其余部分：來(lái)自pBR322質(zhì)粒。表達(dá)誘導(dǎo)物： IPTG（乳糖的類(lèi)似物，不會(huì)被降解）阻遏物IPTG第38頁(yè)/共168頁(yè)第三十九頁(yè)，共169頁(yè)。必須選擇(xunz)一個(gè)有l(wèi)acI的宿主菌。條件(tiojin)：第39頁(yè)/共168頁(yè)第四十頁(yè)，共169頁(yè)。載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌(xjn)的分泌信號(hào)肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。如：pIN III系列(xli)： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）組成結(jié)構(gòu)第40頁(yè)/共168頁(yè)第四十

15、一頁(yè)，共169頁(yè)。Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入(ch r)位點(diǎn)Ipp（脂蛋白基因(jyn)啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)基因：lac IS-D序列和起始(q sh)密碼ATG。分泌信號(hào)肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)）。 強(qiáng)啟動(dòng)子：第41頁(yè)/共168頁(yè)第四十二頁(yè)，共169頁(yè)。以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建(u jin)的。調(diào)節(jié)基因不必借助于宿主的lacI.第42頁(yè)/共168頁(yè)第四十三頁(yè)，共169頁(yè)。表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接(linji)在一起的。啟動(dòng)子：tac操縱基因(jyn)：lacP調(diào)節(jié)基因(jyn)：lacIS-D

16、序列（1）優(yōu)點(diǎn)（2）組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。22第43頁(yè)/共168頁(yè)第四十四頁(yè)，共169頁(yè)。lacItac lac OS-D/ATGGST插入(ch r)位點(diǎn)TGAlacPori：pBR322 ori融合(rngh)肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST融合蛋白(dnbi)用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化。第44頁(yè)/共168頁(yè)第四十五頁(yè)，共169頁(yè)。用凝血酶或Xa因子(ynz)可以把外源蛋白從GST上切下來(lái)。柱（column）GST外源蛋白(dnbi)凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脫柱（column）可再利用第45頁(yè)/共168頁(yè)第四十六頁(yè)

17、，共169頁(yè)。插入(ch r)區(qū)：pGEX-1TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶第46頁(yè)/共168頁(yè)第四十七頁(yè)，共169頁(yè)。CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶ATC GAA G

18、GT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子(ynz)pGEX-2X的插入(ch r)區(qū)：pGEX-3X的插入(ch r)區(qū)：Sma ISma I第47頁(yè)/共168頁(yè)第四十八頁(yè)，共169頁(yè)。His-tag（組氨酸標(biāo)簽(bioqin)）：在外源多肽(du ti)的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來(lái)，可以純化蛋白質(zhì)。第48頁(yè)/共168頁(yè)第四十九頁(yè)，共169

19、頁(yè)。5-TTGACA-35-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）1. 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(jigu)對(duì)表達(dá)效率的影響RNA聚合酶 亞基的識(shí)別(shbi)位點(diǎn)（1）一致順序第49頁(yè)/共168頁(yè)第五十頁(yè)，共169頁(yè)。間隔(jin g)為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。（3） -35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序(shnx)越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。5-TTGACATATAAT一致順序lactrpPLrecAtac Itac II5-TTTACATATGTT5-TTGACATTAACT5-TTGACAGATACT5-TTGATATATAAT5-TTGACATATAAT5-TTGACAT

20、TTAAT-35box-10box第50頁(yè)/共168頁(yè)第五十一頁(yè)，共169頁(yè)。5-AGGAGGU-3S-D序列后面的4個(gè)堿基：如果是A（T）, 翻譯效率(xio l)最高；如果是G（C）,效率(xio l)只有50%或25%。（1）S-D序列(xli)？第51頁(yè)/共168頁(yè)第五十二頁(yè)，共169頁(yè)。AUG左側(cè)(zu c)的三個(gè)堿基也有影響。-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效(yuxio)；如果是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍。第52頁(yè)/共168頁(yè)第五十三頁(yè)，共169頁(yè)。SD序列(xli)與翻譯起始密碼子之間的距離為3-9個(gè)堿基。 在翻譯起始區(qū)周?chē)男蛄?xl

21、i)不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第53頁(yè)/共168頁(yè)第五十四頁(yè)，共169頁(yè)。3. 啟動(dòng)子與外源基因(jyn)之間的距離第54頁(yè)/共168頁(yè)第五十五頁(yè)，共169頁(yè)。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費(fèi)源量和能量(nngling)、不會(huì)干擾正常的表達(dá)。增加載體(zit)的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達(dá)效率。5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響但過(guò)度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長(zhǎng)。第55頁(yè)/共168頁(yè)第五十六頁(yè)，共169頁(yè)。選擇(xunz)強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如tac 等2. 調(diào)整S-D序列(xli)與AUG堿的距離距離過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短

22、都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離。3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為3-9bp。能提高翻譯的起始效率。第56頁(yè)/共168頁(yè)第五十七頁(yè)，共169頁(yè)。4. 增加(zngji)mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性5. 減輕宿主細(xì)胞(xbo)的代謝負(fù)荷合理地調(diào)節(jié)代謝(dixi)負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。將宿主生長(zhǎng)代謝與外源基因表達(dá)分開(kāi)。（1）誘導(dǎo)表達(dá) 一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。去除轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異終止，加入抗終止的序列元件，加放正常轉(zhuǎn)錄終止序列。選用RNase缺失的受體菌第57頁(yè)/共168頁(yè)第五十八頁(yè)，共169頁(yè)。cI857阻遏物有活性，抑制PL啟動(dòng)子，外源基因(jyn)不表

23、達(dá)，宿主大量生長(zhǎng)。32C:42C:cI857阻遏物失活，PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，外源基因高水平表達(dá)，宿主(szh)生長(zhǎng)受到限制。cI857PL外源基因(jyn)PO第58頁(yè)/共168頁(yè)第五十九頁(yè)，共169頁(yè)。調(diào)節(jié)基因lac I（位于宿主(szh)基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無(wú)IPTG:阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄(zhun l)。宿主大量生長(zhǎng)。有IPTG:阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄(zhun l)。宿主生長(zhǎng)受抑制。第59頁(yè)/共168頁(yè)第六十頁(yè)，共169頁(yè)。將宿主的生長(zhǎng)(shngzhng)與載體的復(fù)制分開(kāi)。當(dāng)宿主大量生長(zhǎng)后，再誘導(dǎo)載體制(tzh)粒的

24、復(fù)制，增加拷貝數(shù)。當(dāng)需要宿主大量生長(zhǎng)時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。第60頁(yè)/共168頁(yè)第六十一頁(yè)，共169頁(yè)。N末端(m dun)：由原核基因編碼一段多肽，C末端(m dun)：是完整的真核外源基因。這是避免被降解(jin ji)的最好措施。質(zhì)粒基因產(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。第61頁(yè)/共168頁(yè)第六十二頁(yè)，共169頁(yè)。使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。大腸桿菌(d chn n jn)的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶?？砂裵in增加到載體上。減少宿主菌本身(bnshn)的蛋白

25、酶的表達(dá)。第62頁(yè)/共168頁(yè)第六十三頁(yè)，共169頁(yè)。細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)外(niwi)膜到培養(yǎng)液中?！胺置凇保?蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)膜到周間質(zhì)中。第63頁(yè)/共168頁(yè)第六十四頁(yè)，共169頁(yè)。位于(wiy)N端，一般為15-30aa 。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似, 功能相似，可以互換。 堿性(jin xn)氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)切割位點(diǎn)Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號(hào)肽酶外源蛋白 有信號(hào)肽。第64頁(yè)/共168頁(yè)第六十五頁(yè)，共169頁(yè)。 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)(zhun yn)機(jī)制。真核細(xì)胞中的分泌(fnm)蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌(fnm)表達(dá)

26、；但非分泌(fnm)蛋白很難在大腸桿菌中分泌(fnm)。信號(hào)(xnho)肽酶I、信號(hào)(xnho)肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。 蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa 序列。為蛋白指明目的地。第65頁(yè)/共168頁(yè)第六十六頁(yè)，共169頁(yè)。分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異構(gòu)酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確(zhngqu)折疊。1. 形成(xngchng)正確的二硫鍵 第66頁(yè)/共168頁(yè)第六十七頁(yè)，共169頁(yè)。第67頁(yè)/共168頁(yè)第六十八頁(yè)，共169頁(yè)?？贵w(kngt)分子人血紅蛋白(xuhng dnbi)分子第68頁(yè)/共168頁(yè)第六十九頁(yè)，共169頁(yè)。如信號(hào)肽、內(nèi)含(ni hn)肽（intein）等序列的切

27、割。第69頁(yè)/共168頁(yè)第七十頁(yè)，共169頁(yè)。（1）O-糖基化（Ser, Thr）增加(zngji)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。糖基第70頁(yè)/共168頁(yè)第七十一頁(yè)，共169頁(yè)。（2）N-糖基化（Asn）Dol：長(zhǎng)醇Mannose：甘露(gnl)糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基(nj)葡萄糖第71頁(yè)/共168頁(yè)第七十二頁(yè)，共169頁(yè)。磷酸化、乙?；?、硫酸(li sun)化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、軟脂化羥脯氨酸甲基組氨酸羥賴(lài)氨酸羧基(su j)谷氨酸第72頁(yè)/共168頁(yè)第七十三頁(yè)，共169頁(yè)。缺乏(quf)蛋白質(zhì)的加工。（如糖基化、氨基酸修飾等）。第73頁(yè)/共168頁(yè)第七

28、十四頁(yè)，共169頁(yè)。酵母菌、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)(piyng)細(xì)胞等。真核或病毒(bngd)啟動(dòng)子MCSPolyA信號(hào)終止子外源基因第74頁(yè)/共168頁(yè)第七十五頁(yè)，共169頁(yè)。 能在中克隆(k ln)和擴(kuò)增。1. 酵母(jiom)克隆載體Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; 有合適的克隆位點(diǎn)。 有酵母的選擇標(biāo)記Ori有大腸桿菌的選擇標(biāo)記Ampr、Tetr。第75頁(yè)/共168頁(yè)第七十六頁(yè)，共169頁(yè)。Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast) cells第76頁(yè)/共168頁(yè)第七十七頁(yè)，共169頁(yè)。由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷（

29、選擇標(biāo)記(bioj)）構(gòu)成。ColE1酵母(jiom)Leu 2+如 PYeleu10:第77頁(yè)/共168頁(yè)第七十八頁(yè)，共169頁(yè)。轉(zhuǎn)化(zhunhu)率低（1-10轉(zhuǎn)化(zhunhu)子/微克DNA）。載體上只有細(xì)菌的復(fù)制(fzh)區(qū)，沒(méi)有酵母的自主復(fù)制(fzh)區(qū)?？膳c受體細(xì)胞的染色體DNA同源重組，隨染色體一起復(fù)制。不能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制整合到酵母的染色體上不能從酵母細(xì)胞中提取載體。第78頁(yè)/共168頁(yè)第七十九頁(yè)，共169頁(yè)。由大腸桿菌(d chn n jn)質(zhì)粒和酵母的DNA片斷(選擇標(biāo)記和酵母DNA自主復(fù)制順序ARS）構(gòu)成。大腸桿菌(d chn n jn)質(zhì)粒酵母(jiom)ARS

30、酵母選擇標(biāo)記第79頁(yè)/共168頁(yè)第八十頁(yè)，共169頁(yè)。ARS（automously replicating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守(boshu)區(qū)第80頁(yè)/共168頁(yè)第八十一頁(yè)，共169頁(yè)。轉(zhuǎn)化(zhunhu)率高（102-103轉(zhuǎn)化(zhunhu)子/微克DNA) 。不穩(wěn)定(wndng)，容易丟失。可從大腸桿菌和酵母中提取質(zhì)粒。既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制。穿梭載體（shuttle vector）第81頁(yè)/共168頁(yè)第八十二頁(yè)，共169頁(yè)。在YRp質(zhì)粒中插入(ch r)酵母染色體的著絲粒區(qū)。特點(diǎn)(tdin)：YRp質(zhì)粒酵母(ji

31、om)著絲粒不易從細(xì)胞中提取。行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。單拷貝存在。第82頁(yè)/共168頁(yè)第八十三頁(yè)，共169頁(yè)。由大腸桿菌(d chn n jn)質(zhì)粒、2m質(zhì)粒及酵母染色體DNA選擇標(biāo)記構(gòu)成。大腸桿菌(d chn n jn)質(zhì)粒酵母選擇(xunz)標(biāo)記2m質(zhì)粒如pYF92:pBR3222m酵母his 3+第83頁(yè)/共168頁(yè)第八十四頁(yè)，共169頁(yè)。釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長(zhǎng)度是2m 。含有(hn yu)自主復(fù)制起始區(qū)ori和STB序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。第84頁(yè)/共168頁(yè)第八十五頁(yè)，共169頁(yè)。很高的轉(zhuǎn)化活性（103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA）.拷貝數(shù)多（25-100分子/細(xì)胞(xbo)

32、）。比YRp穩(wěn)定。第85頁(yè)/共168頁(yè)第八十六頁(yè)，共169頁(yè)。YEp24第86頁(yè)/共168頁(yè)第八十七頁(yè)，共169頁(yè)。Leu- 酵母(jiom)原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG整合到染色體上，或獨(dú)立在酵母(jiom)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化(zhunhu)Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長(zhǎng)酵母載體大腸桿菌提取插入外源基因鑒定克隆發(fā)酵表達(dá)外源基因產(chǎn)物分離、純化第87頁(yè)/共168頁(yè)第八十八頁(yè)，共169頁(yè)。 （1）優(yōu)點(diǎn)(yudin)對(duì)其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究比較深入。小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應(yīng)器中都能生長(zhǎng)。已經(jīng)分離出很強(qiáng)的啟動(dòng)子。有翻譯后的加工。本身自然分泌很少，便于(biny)胞外蛋白的純 化。安全性高（FD

33、A確認(rèn)的安全生物），不 需要宿主的安全性檢驗(yàn)。第88頁(yè)/共168頁(yè)第八十九頁(yè)，共169頁(yè)。常常(chngchng)發(fā)生質(zhì)粒丟失。重組蛋白常常(chngchng)超糖基化表達(dá)(biod)量普遍低。每個(gè)N-寡糖鏈上含有100多個(gè)甘露糖，分泌困難。正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有8-13個(gè)甘露糖。分泌型蛋白有時(shí)會(huì)留在壁膜間隙，第89頁(yè)/共168頁(yè)第九十頁(yè)，共169頁(yè)。第90頁(yè)/共168頁(yè)第九十一頁(yè)，共169頁(yè)。24第91頁(yè)/共168頁(yè)第九十二頁(yè)，共169頁(yè)。（1）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)(biod)例：人Cu/Zn-SOD在酵母(jiom)中表達(dá)：超氧化物H+H2O2H2O過(guò)氧化物酶表達(dá)出的SOD修飾正確：起始氨基酸

34、被切掉，第二個(gè)氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶)第92頁(yè)/共168頁(yè)第九十三頁(yè)，共169頁(yè)。宿主(szh)：亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD：甘油醛磷酸(ln sun)脫氫酶第93頁(yè)/共168頁(yè)第九十四頁(yè)，共169頁(yè)。在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。需要(xyo)糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。方法(fngf)：在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類(lèi)型因子a1的前導(dǎo)肽，與重組蛋白的N端通過(guò)Lys-Arg相連。前導(dǎo)肽（leader peptide）：第94頁(yè)/共168頁(yè)第九十五頁(yè)，共169頁(yè)。蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時(shí)，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶識(shí)別這個(gè)切點(diǎn)(qidin)信號(hào)，把重

35、組蛋白正確切下來(lái)。前導(dǎo)(qindo)肽Lys-Arg重組蛋白（水蛭素）內(nèi)切蛋白酶第95頁(yè)/共168頁(yè)第九十六頁(yè)，共169頁(yè)。（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母(jiom)中表達(dá)在大型發(fā)酵反應(yīng)器中容易生長(zhǎng)；以甲醇(ji chn)作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇(ji chn)時(shí)，表達(dá)的乙醇氧化酶高達(dá)胞內(nèi)總蛋白的40%！嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特點(diǎn)第96頁(yè)/共168頁(yè)第九十七頁(yè)，共169頁(yè)。HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作為疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因1啟動(dòng)子（受甲醇激活調(diào)控(dio kn)）。His4：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶基因。3-aox1：整合到特定染色體的位點(diǎn)

36、序列。誘導(dǎo)(yudo)物：甲醇。產(chǎn)量：9106劑疫苗/240L發(fā)酵罐。第97頁(yè)/共168頁(yè)第九十八頁(yè)，共169頁(yè)。第98頁(yè)/共168頁(yè)第九十九頁(yè)，共169頁(yè)。作為飼料添加劑促進(jìn)反芻動(dòng)物(fn ch dn w)消化。產(chǎn)量(chnling)：10L，200h連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)出50g溶菌酶。第99頁(yè)/共168頁(yè)第一百頁(yè)，共169頁(yè)。1. 桿狀病毒（Baculovirus）廣泛侵染(qn rn)包括許多昆蟲(chóng)在內(nèi)的無(wú)脊椎動(dòng)物。（1）侵染(qn rn)周期：兩種形式單獨(dú)病毒粒子形式病毒粒子宿主細(xì)胞病毒粒子侵染釋放第100頁(yè)/共168頁(yè)第一百零一頁(yè)，共169頁(yè)。病毒(bngd)粒子宿主(szh)細(xì)胞侵染(qn r

37、n)宿主細(xì)胞侵染合成多角體蛋白裂解釋放多面體溶解一般使用苜蓿銀紋夜蛾細(xì)胞核型多角體病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）第101頁(yè)/共168頁(yè)第一百零二頁(yè)，共169頁(yè)。感染后36-48h，病毒開(kāi)始合成(hchng)大量的 多角蛋白。多角蛋白的啟動(dòng)子特別(tbi)強(qiáng)。多角蛋白基因可以被替換掉而不影響 病毒的繁殖。第102頁(yè)/共168頁(yè)第一百零三頁(yè)，共169頁(yè)。多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力(nngl)的病毒粒子，但不能形成多面體。通過(guò)(tnggu)顯微鏡檢查看是否有多面體形成。

38、源自草地夜蛾的細(xì)胞株，在這種細(xì)胞中，多角蛋白的啟動(dòng)子特別活躍。第103頁(yè)/共168頁(yè)第一百零四頁(yè)，共169頁(yè)。（1）轉(zhuǎn)移(zhuny)載體的構(gòu)建大腸桿菌(d chn n jn)質(zhì)粒，插入兩段AcMNPV序列以供同源重組。桿狀病毒的基因組太大（13kb環(huán)狀DNA），不能直接插入。必須使用同源重組的辦法。多角蛋白的啟動(dòng)子和終止子及polyA加尾信號(hào)。啟動(dòng)子與終止子之間插入多克隆位點(diǎn)第104頁(yè)/共168頁(yè)第一百零五頁(yè)，共169頁(yè)。第105頁(yè)/共168頁(yè)第一百零六頁(yè)，共169頁(yè)。 轉(zhuǎn)移(zhuny)載體中插入外源基因 轉(zhuǎn)移載體與野生型AcMNPV DNA共同轉(zhuǎn)染宿主(szh)細(xì)胞 轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組

39、發(fā)生雙交換 外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中 重組病毒侵染宿主4-5天后即可收獲重組蛋白。第106頁(yè)/共168頁(yè)第一百零七頁(yè)，共169頁(yè)。第107頁(yè)/共168頁(yè)第一百零八頁(yè)，共169頁(yè)。第108頁(yè)/共168頁(yè)第一百零九頁(yè)，共169頁(yè)。桿狀病毒侵染昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，在幼蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)外源蛋白，成為“低成本蛋白工廠(gngchng)”。22只粉蚊夜蛾幼蟲(chóng)4天后表達(dá)的人腺苷酸脫氫酶占幼蟲(chóng)總蛋白的2%-5%。共產(chǎn)出9mg很純的產(chǎn)物。（1）壽命短感染4-5天后宿主細(xì)胞裂解或幼蟲(chóng)(yuchng)死亡。（2）共同轉(zhuǎn)染率低重組率更低。0.1%-1%。第109頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十頁(yè)，共169頁(yè)。存在于能引起(ynq)植物

40、形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱(chēng)腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）。第110頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十一頁(yè)，共169頁(yè)。第111頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十二頁(yè)，共169頁(yè)。環(huán)狀雙鏈DNA，105105bp（185kb）(相當(dāng)于細(xì)菌(xjn)染色體的3%-5%）。第112頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十三頁(yè)，共169頁(yè)。 轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成(hchng)，能隨機(jī)整合到植物的染色體上。長(zhǎng)度一般為12-24kb，是Ti質(zhì)粒最重要的部分。左邊界(binji)右邊界(binji)生長(zhǎng)素基因細(xì)胞分裂素基因冠癭堿合成生長(zhǎng)素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）

41、編碼合成吲哚乙酸（植物生長(zhǎng)激素）的酶iaaM: 色氨酸-2-單加氧酶第113頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十四頁(yè)，共169頁(yè)。色氨酸-2-單加氧酶色氨酸吲哚(yn du)-3-乙酰胺iaaH:吲哚(yn du)-3-乙酰胺水解酶吲哚(yn du)-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸t(yī)mr（ipt）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶, 催化：二磷酸異戊烯（IPP）異戊烯酰嘌呤單磷酸（IPA）5-AMP第114頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十五頁(yè)，共169頁(yè)。章魚(yú)(zhn y)堿（octopine)胭脂(yn zhi)堿（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2

42、)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg與丙酮酸縮合成(hchng)Arg與酮戊二醛縮合成第115頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十六頁(yè)，共169頁(yè)。農(nóng)桿堿（agropine）冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來(lái)的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他(qt)土壤微生物都不能利用冠癭堿。Glu的二環(huán)糖衍生物。第116頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十七頁(yè)，共169頁(yè)。決定土壤農(nóng)桿菌對(duì)植物(zhw)的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移， 進(jìn)入和整合。vir的產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫離后，可與vir的產(chǎn)物VIR D2蛋白結(jié)合(jih)，并在VIR D4

43、和VIR B蛋白的幫助下穿過(guò)濃桿菌內(nèi)膜、外膜、壁和植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。單鏈的5端是右邊界區(qū)域，含有25bp重復(fù)序列，參與整合。第117頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十八頁(yè)，共169頁(yè)。章魚(yú)堿代謝(dixi)基因和胭脂堿代謝(dixi)基因： 分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌(gnjn)生長(zhǎng)。第118頁(yè)/共168頁(yè)第一百一十九頁(yè)，共169頁(yè)。（1）第一步:植物(zhw)受傷植物受傷后能分泌酚類(lèi)化合物（如乙酰丁香酮、羥基(qingj)乙酰丁香酮），誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達(dá)。第119頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十頁(yè)，共169頁(yè)。（1）第二步 感染(gnrn)植物（3）第三

44、步 毒性基因(jyn)（vir）表達(dá)T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過(guò)量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，形成(xngchng)植物冠癭瘤。膿桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步 T-DNA轉(zhuǎn)移T-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來(lái)，并運(yùn)送到植物細(xì)胞核里，整合到植物基因組中。（5）第五步 誘導(dǎo)冠癭瘤第120頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十一頁(yè)，共169頁(yè)。第121頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十二頁(yè)，共169頁(yè)。（6）第六步 土壤(trng)農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。第122頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十三頁(yè)，共169頁(yè)。根據(jù)(gnj)所編碼的冠癭堿（opine），分為（1）章魚(yú)(zhn

45、 y)堿（octopine)型質(zhì)粒第123頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十四頁(yè)，共169頁(yè)。（3）農(nóng)桿堿（agropine）型質(zhì)粒第124頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十五頁(yè)，共169頁(yè)。裸子植物(luzzhw)、雙子葉被子植物、禾谷類(lèi)單子葉植物（玉米）。（1）能夠自發(fā)地整合到植物(zhw)的染色體上。（2）能轉(zhuǎn)化多種植物(zhw)。（3）強(qiáng)啟動(dòng)子5. Ti質(zhì)粒作為載體的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。25第125頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十六頁(yè)，共169頁(yè)。（1）分子量太大（120kb）?。?）限制性酶切位點(diǎn)太多。（3）被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞成為(chngwi)腫瘤，不能

46、 再分化。（4）在大腸桿菌中不能復(fù)制。第126頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十七頁(yè)，共169頁(yè)。（4）冠癭堿合成對(duì)于植物無(wú)意義(yy)。應(yīng)剔除掉。（5）加入大腸桿菌的ori和選擇(xunz)標(biāo)記。（6）加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號(hào)和結(jié)束(jish)信號(hào)以 及添加polyA的信號(hào)序列。（1）保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分（vir基因， 左右邊界）。（2）減少限制性酶切位點(diǎn)，引入單一插入位 點(diǎn)。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植 物細(xì)胞不再成為腫瘤，能正常分化。第127頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十八頁(yè)，共169頁(yè)。第128頁(yè)/共168頁(yè)第一百二十九頁(yè)，共169頁(yè)。最早獲得(hud)廣泛應(yīng)用的Ti質(zhì)粒是比利時(shí)

47、科學(xué)家等1983年改造的pGV3850需要同源重組才能插入外源基因。是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質(zhì)粒作為中間載體。第129頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十頁(yè)，共169頁(yè)。第130頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十一頁(yè)，共169頁(yè)。宿主(szh)土壤農(nóng)桿菌的選擇標(biāo)記是位于中間載體pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。1）膿桿菌選擇(xunz)標(biāo)記2）最終(zu zhn)受體植物的選擇標(biāo)記卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素對(duì)植物有劇毒?。┑?31頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十二頁(yè)，共169頁(yè)。第132頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十三頁(yè)，共169頁(yè)。第133頁(yè)/共168頁(yè)第一百

48、三十四頁(yè)，共169頁(yè)。既有大腸桿菌復(fù)制(fzh)起點(diǎn)也有農(nóng)桿菌復(fù)制(fzh)起點(diǎn)，是個(gè)穿梭載體。Ti質(zhì)粒被剔除了T-DNA、冠癭堿代謝(dixi)基因、vir基因。大幅度減小質(zhì)粒的體積。（10kb）雙元載體的結(jié)構(gòu)Ti的精髓：Vir基因（轉(zhuǎn)移）和左右界（整合）第134頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十五頁(yè)，共169頁(yè)。第135頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十六頁(yè)，共169頁(yè)。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之前，所有的克隆步驟(bzhu)都在大腸桿菌里操作。受體農(nóng)桿菌內(nèi)要求帶有整套vir基因(jyn)（但缺失T-DNA及左右邊界）的“幫助質(zhì)?！碧峁﹙ir產(chǎn)物。1）基因插入2）幫助質(zhì)粒（ helper plasmid）Vir產(chǎn)物使雙元載

49、體上的T-DNA左右邊界及其外源基因轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞，并整合到植物染色體上。第136頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十七頁(yè)，共169頁(yè)。左右外源基因(jyn)雙元載體(zit)Vir幫助(bngzh)質(zhì)粒農(nóng)桿菌Vir農(nóng)桿菌左右外源基因感染植物轉(zhuǎn)化左右外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞核，整合，表達(dá)第137頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十八頁(yè)，共169頁(yè)。含雙元載體(zit)的大腸桿菌：含有外源基因(jyn)和左右邊界。含有幫助質(zhì)粒的輔助細(xì)菌：含vir基因。受體農(nóng)桿菌（空）：三種菌混合培養(yǎng)，然后通過(guò)各自的抗菌素抗性標(biāo)記選擇吸收了外源基因、左右界、和Vir的農(nóng)桿菌。第138頁(yè)/共168頁(yè)第一百三十九頁(yè)，共169頁(yè)。1.動(dòng)物細(xì)胞基因

50、克隆和表達(dá)(biod)載體-SV40病毒常用的SV40載體，是從猿猴(yunhu)空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而來(lái)的。第139頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十頁(yè)，共169頁(yè)。 20面體外殼(wi k)：由VP1、VP2和VP3三種(sn zhn)病毒外殼蛋白構(gòu)成。5243bp的環(huán)狀雙鏈。 DNA：第140頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十一頁(yè)，共169頁(yè)。SV40猿猴(yunhu)細(xì)胞細(xì)胞(xbo)裂解釋放(shfng)SV40嚙齒類(lèi)細(xì)胞細(xì)胞癌變SV40DNA整合到寄主染色體上permissivenonpermissive第141頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十二頁(yè)，共1

51、69頁(yè)。T-抗原(kngyun)（tumor antigen）:兩個(gè)6聚體的T抗原結(jié)合在SV40 DNA的復(fù)制起始點(diǎn)上，分別向相反方向移動(dòng)，將雙鏈DNA解螺旋。隨后(suhu)單鏈DNA結(jié)合蛋白（ssB）與解開(kāi)的單鏈DNA結(jié)合維持解旋狀態(tài)。解鏈SV40編碼的蛋白。功能是在SV40 DNA復(fù)制的時(shí)候解開(kāi)DNA雙鏈。第142頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十三頁(yè)，共169頁(yè)。第143頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十四頁(yè)，共169頁(yè)。第144頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十五頁(yè)，共169頁(yè)。T抗原(kngyun)SV40 DNA雙鏈第145頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十六頁(yè)，共169頁(yè)。5-CTCACTACTTCTGGAATAGC

52、3-GAGTGATGAAGACCTTATCG120早期回文(hu wn)序列TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA2147T抗原(kngyun)結(jié)合位點(diǎn)GCATAAATAAAAAAAATTAGTCCGTATT TATTTT TTTTAATCAG富含AT區(qū)4869第146頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十七頁(yè)，共169頁(yè)。早期(zoq)表達(dá)區(qū)：編碼(bin m)大T抗原（控制DNA復(fù)制）和小t抗原。晚期表達(dá)區(qū)：在DNA復(fù)制一段時(shí)間后表達(dá)，產(chǎn)物是VP1、VP2和VP3三種外殼蛋白。第147頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十八頁(yè)，共169頁(yè)。對(duì)非受納

53、細(xì)胞（non permissive cells），只有T 抗原表達(dá)(biod)，隨后病毒基因組隨機(jī)整合到宿主染色體上。SV40整合(zhn h)有嚴(yán)格的包裝限制。如果插入的外源基因過(guò)大，就無(wú)法包裝。第148頁(yè)/共168頁(yè)第一百四十九頁(yè)，共169頁(yè)。去掉一部分DNA(T抗原(kngyun)或者VP基因）。助手(zhshu)型SV40去掉T抗原基因的病毒，保留晚期(wnq)復(fù)制啟動(dòng)子。提供外殼蛋白。不能復(fù)制，但能包裝。第149頁(yè)/共168頁(yè)第一百五十頁(yè)，共169頁(yè)。需要這兩種缺陷型病毒混合感染，才能互補(bǔ)。既能使插入SV40的外源基因復(fù)制(fzh)，又能使外源基因被包裝進(jìn)病毒顆粒，得以擴(kuò)增。去掉VP

54、基因，插入外源基因的病毒(bngd)，保留早期表達(dá)啟動(dòng)子。不能包裝，但能復(fù)制。重組(zhn z)型SV40包裝重組型SV40提供重組DNA和T抗原。第150頁(yè)/共168頁(yè)第一百五十一頁(yè)，共169頁(yè)。助手型SV40: 提供(tgng)VP外殼蛋白。重組型SV40： 提供(tgng)T抗原。包裝成的病毒顆粒中，既有含外源基因的重組(zhn z)型，又有助手型DNA。感染細(xì)胞，整合第151頁(yè)/共168頁(yè)第一百五十二頁(yè)，共169頁(yè)。用復(fù)制起點(diǎn)(qdin)有缺陷的SV40病毒侵染的猴細(xì)胞株CV-1得到的。所以稱(chēng)COS（CV-1，Origin, SV40）病毒不能復(fù)制，但能產(chǎn)生T抗源（類(lèi)似重組型SV40）

55、。DNA整合到猴染色體上。所以COS細(xì)胞中只有T抗原(kngyun)，無(wú)游離的SV40DNA。 COS細(xì)胞的特點(diǎn)：有SV40的T抗原。有利于SV40來(lái)源的載體復(fù)制第152頁(yè)/共168頁(yè)第一百五十三頁(yè)，共169頁(yè)。第153頁(yè)/共168頁(yè)第一百五十四頁(yè)，共169頁(yè)。利用(lyng)COS細(xì)胞擴(kuò)增外源基因第154頁(yè)/共168頁(yè)第一百五十五頁(yè)，共169頁(yè)。只保留SV40的復(fù)制起始區(qū)（ori）、早期區(qū)域（T抗原(kngyun)）的啟動(dòng)子、Poly A化位置以及t抗原(kngyun)的內(nèi)含子。如pSV2:a區(qū): 1-323bp，SV40的復(fù)制起始區(qū)、T抗原啟 動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。b區(qū)：324-3369bp，pBR322的復(fù)制起始區(qū)、 氨芐