microRNA沉默技術(shù).PPT

1、目錄目錄microRNAsmicroRNAs背景知識(shí)介紹背景知識(shí)介紹microRNAs的背景知識(shí)介紹mRNA：信使RNA，轉(zhuǎn)錄的模板tRNA ：轉(zhuǎn)運(yùn)RNArRNA：核糖體RNAmicroRNA：微小RNA，起基因調(diào)控作用。hnRNA：不均一核RNA，多為mRNA的前體snRNA：小核RNA ,對(duì)RNA加工方面起作用。ssRNA:作為病毒的線狀單鏈遺傳物質(zhì)dsRNA：作為病毒的線狀雙鏈遺傳物質(zhì)siRNA：小干擾RNASat-RNA：衛(wèi)星RNATR：端粒酶RNA，組成端粒酶的成分之一核酶RNA：起催化反應(yīng)的RNA。尊重下彼此的智商這些大家都懂的。4microRNAs的背景知識(shí)介紹microRNA的

2、簡(jiǎn)介的簡(jiǎn)介microRNA前體模型l非編碼非編碼RNA，不翻譯蛋，不翻譯蛋 白質(zhì)白質(zhì)l分子量小，僅有分子量小，僅有18-25個(gè)個(gè)核苷酸構(gòu)成核苷酸構(gòu)成l廣泛存在于果蠅，線蟲，廣泛存在于果蠅，線蟲，植物，人體等真核生物中植物，人體等真核生物中l(wèi)高度保守高度保守l具有組織特異性和時(shí)效具有組織特異性和時(shí)效性性l對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控起作對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控起作用用5microRNAs的背景知識(shí)介紹microRNAs的轉(zhuǎn)錄與加工的轉(zhuǎn)錄與加工miRNA基因基因Pri-miRNAPre-miRNAmicroRNA靶靶mRNA6microRNAmicroRNA沉默技術(shù)意義沉默技術(shù)意義microRNAs沉默技術(shù)的意義mi

3、croRNAs參與的生參與的生理過程理過程脂肪代謝脂肪代謝細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡激素分泌激素分泌時(shí)序發(fā)育時(shí)序發(fā)育病毒復(fù)制病毒復(fù)制細(xì)胞分化細(xì)胞分化神經(jīng)元發(fā)育神經(jīng)元發(fā)育腫瘤腫瘤發(fā)生發(fā)生發(fā)展發(fā)展8microRNAs沉默技術(shù)的意義腫瘤心血管疾病肌肉功能障礙病毒感染神經(jīng)類疾病在許多疾病中，在許多疾病中，microRNA的表達(dá)均有顯的表達(dá)均有顯著變化著變化高血壓病人的高血壓病人的microRNA表達(dá)變化表達(dá)變化9microRNAs沉默技術(shù)的意義科研上，利用科研上，利用microRNA沉默技沉默技術(shù)可以研究術(shù)可以研究microRNAs的功能，的功能，并以此研究基因的調(diào)控機(jī)制。并以此研究基因的調(diào)控機(jī)制。（看上圖）（

4、看上圖）在醫(yī)療上，在醫(yī)療上，microRNAs沉默技術(shù)可以沉默技術(shù)可以用作基因治療，調(diào)控代謝，治療疾用作基因治療，調(diào)控代謝，治療疾病（沒有圖）?。]有圖）所以這所以這技術(shù)到技術(shù)到底有什底有什么用？么用？10microRNAsmicroRNAs沉默技術(shù)沉默技術(shù)microRNAs沉默技術(shù)microRNAs的轉(zhuǎn)錄與加工的轉(zhuǎn)錄與加工無效或低無效或低效沉默效沉默高效沉默高效沉默12microRNAs沉默技術(shù)用單純的用單純的反義寡核苷酸反義寡核苷酸抑制抑制miRNA效果差！效果差！反義寡核苷酸鏈與反義寡核苷酸鏈與miRNA之間之間親和力低！穩(wěn)定性差！親和力低！穩(wěn)定性差！分子改造！分子改造！1.1.提高親和

5、力！提高親和力！2.2.延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間！13Antagomir寡核苷酸Morpholino寡核苷酸鎖核酸（LNA）肽核酸（PNA）以下是一些經(jīng)常用于沉默以下是一些經(jīng)常用于沉默miRNA的改造分的改造分子，接下來會(huì)一一為您介紹。子，接下來會(huì)一一為您介紹。14Antagomir寡核苷酸1.每個(gè)核苷酸的呋喃糖每個(gè)核苷酸的呋喃糖2碳碳上加甲基。上加甲基。2.兩端用磷硫酰修飾。兩端用磷硫酰修飾。磷硫酰修飾磷硫酰修飾1.提高了對(duì)核酸酶提高了對(duì)核酸酶的耐受性。的耐受性。2.延長(zhǎng)了在胞內(nèi)的延長(zhǎng)了在胞內(nèi)的半衰期。半衰期。甲基甲基甲基甲基15鎖核酸（LNA）1.1.一個(gè)一個(gè)亞甲基橋亞甲基橋連

6、接核糖連接核糖的的22氧和氧和44碳。碳。1.1.鎖定內(nèi)部構(gòu)象，降低可鎖定內(nèi)部構(gòu)象，降低可塑性，增強(qiáng)骨架穩(wěn)定性。塑性，增強(qiáng)骨架穩(wěn)定性。2.2.與與miRNAmiRNA親和力顯著提高。親和力顯著提高。3.3.有良好的錯(cuò)配識(shí)別能力。有良好的錯(cuò)配識(shí)別能力。4.4.沒有毒副作用。沒有毒副作用。5.5.在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性也在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性也較強(qiáng)。較強(qiáng)。16肽核酸（PNA）Morpholino寡核苷酸人工合成的以嗎啉環(huán)人工合成的以嗎啉環(huán)為骨架的為骨架的DNA類似物。類似物。以中性的肽鏈酰胺以中性的肽鏈酰胺2-氨基氨基乙基甘氨酸鍵取代乙基甘氨酸鍵取代DNA中中的戊糖磷酸二酯鍵的的戊糖磷酸二酯鍵的DNA類似

7、物。類似物。1.靶向于靶向于miRNA的溶核加工位的溶核加工位點(diǎn)，抑制點(diǎn)，抑制miRNA的成熟。的成熟。2.微量而高效性。微量而高效性。1.不帶電，與不帶電，與miRNA結(jié)合沒結(jié)合沒有靜電排斥，也不受鹽濃有靜電排斥，也不受鹽濃度影響。穩(wěn)定性與特異性度影響。穩(wěn)定性與特異性也大幅提升。也大幅提升。17提呈系統(tǒng)提呈系統(tǒng)所謂所謂“提呈系統(tǒng)提呈系統(tǒng)”，就是把剛，就是把剛才說過的才說過的“miRNAmiRNA沉默沉默”分子導(dǎo)分子導(dǎo)入到特定的細(xì)胞中與特定入到特定的細(xì)胞中與特定miRNAmiRNA起作用的機(jī)制，懂了嗎？起作用的機(jī)制，懂了嗎？從化學(xué)性質(zhì)上講，從化學(xué)性質(zhì)上講，miRNA沉默分子與沉默分子與miRN

8、A，siRNA是非常相似的。常見的是非常相似的。常見的提呈系統(tǒng)有提呈系統(tǒng)有膽固醇偶聯(lián)法膽固醇偶聯(lián)法，高密度脂蛋高密度脂蛋白偶聯(lián)法白偶聯(lián)法，低密度脂蛋白偶聯(lián)法低密度脂蛋白偶聯(lián)法，抗體抗體偶聯(lián)法偶聯(lián)法等。等。miRNA沉默分子沉默分子靶向作用靶向作用分子分子具有靶向作用的具有靶向作用的miRNA沉默分子沉默分子18實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠沉默分子：沉默分子：antagomir-122提呈系統(tǒng)：膽固醇偶聯(lián)提呈系統(tǒng)：膽固醇偶聯(lián)注射方式：尾靜脈注射注射方式：尾靜脈注射靶分子：靶分子：miR-122（肝臟）（肝臟）實(shí)驗(yàn)進(jìn)程實(shí)驗(yàn)進(jìn)程1 1就就是是我我啦！啦！20northern biotnorthern

9、 biot分析分析提示：pS：部分改變修飾成分fS：全部改變修飾成分Mm：有4個(gè)位點(diǎn)突變21實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠沉默分子：沉默分子：antagomir-16提呈系統(tǒng)：無提呈系統(tǒng)：無注射方式：尾靜脈注射注射方式：尾靜脈注射靶分子：靶分子：miR-16（全身）（全身）實(shí)驗(yàn)進(jìn)程實(shí)驗(yàn)進(jìn)程怎怎么么還還是是我我！22northern biotnorthern biot分析分析1.能實(shí)現(xiàn)大范圍的能實(shí)現(xiàn)大范圍的miRNA抑制效果。抑制效果。2.對(duì)腦的對(duì)腦的miRNA抑抑制效果不明顯。制效果不明顯。3.對(duì)在骨髓中的對(duì)在骨髓中的pre-miRNA無明顯抑制無明顯抑制效果。效果。23實(shí)驗(yàn)進(jìn)程實(shí)驗(yàn)進(jìn)程3 3目

10、的：對(duì)基因表達(dá)量的影響目的：對(duì)基因表達(dá)量的影響沉默分子：沉默分子：antigomir-122強(qiáng)化因子：強(qiáng)化因子：腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)mir-122試驗(yàn)動(dòng)物：小鼠試驗(yàn)動(dòng)物：小鼠試驗(yàn)動(dòng)物：小鼠試驗(yàn)動(dòng)物：小鼠一直都是我咯！一直都是我咯！24全全RNARNA提取，進(jìn)行微陣列數(shù)提取，進(jìn)行微陣列數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)強(qiáng)度據(jù)分析基因表達(dá)強(qiáng)度至少至少11個(gè)基因的表達(dá)水平下降。個(gè)基因的表達(dá)水平下降。部分相同的基因表達(dá)強(qiáng)化。部分相同的基因表達(dá)強(qiáng)化。（大部分是與膽固醇生化合成（大部分是與膽固醇生化合成相關(guān)的基因）相關(guān)的基因）25表型分析表型分析Hmgcr（3羥基羥基3甲基戊二酰輔酶甲基戊二酰輔酶A還原酶，膽固醇合成途徑的

11、限速酶）活性下降還原酶，膽固醇合成途徑的限速酶）活性下降約約45%。血漿膽固醇含量下降血漿膽固醇含量下降44%。26mRNA沉默分子miRNA配配對(duì)對(duì)結(jié)結(jié)合合配配對(duì)對(duì)結(jié)結(jié)合合抑抑制制抑抑制制28mRNA沉默分子miRNA基因B基因A環(huán)境蛋白質(zhì)（酶）人工合成29哲理思考事物之間的聯(lián)系的普遍的，事物之間的聯(lián)系的普遍的，萬物相生相克，牽一發(fā)而動(dòng)全身萬物相生相克，牽一發(fā)而動(dòng)全身馬克思（1818-1883）mRNA沉默分子miRNA基因B基因A環(huán)境蛋白質(zhì)（酶）人工合成30致謝謝謝觀賞！謝謝觀賞！祝大家暑假快樂。祝大家暑假快樂。參考文獻(xiàn)：Joshi SR, McLendon JM, Comer BS, Gerthoffer WT. MicroRNAs-control of essential genes: Implications for pulmonary vascular disease. Pulmonary circulation. 2011 ;1:357-64.Jan Krutzfeldt1, Nikolaus Rajewsky3, Ravi Braich, Kallanthottathil G. Rajeev, Thomas Tuschl,Muthiah Manoharan & Markus Stoffel. S