植物花青素生物合成與調控研究進展

1、    植物花青素生物合成與調控研究進展    梁立軍 楊祎辰 王二歡摘要 花青素是植物體內非常重要的一類次生代謝物，有很強的藥理活性?；ㄇ嗨卦卺t(yī)藥保健、藥用植物開發(fā)等方面具有重要的研究價值和應用潛力。目前研究者基本探明了花青素生物合成途徑和分子調控機制，但還沒有完全掌握花青素合成的整個網絡體系，還需要繼續(xù)加強對花青素生物合成與調控的研究。因此，對植物花青素生物合成途徑、反應酶、結構基因、調控基因及轉錄因子進行綜述，旨在為花青素類植物品種改良和開發(fā)提供理論支持。關鍵詞 花青素；生物合成；調控q943 a 0517-6611（2018）21-0018-07

2、abstract plant anthocyanin was，a group of important second plant metabolites with potent pharmacological activity，anthocyanin has important research value and application potential in health care and development of medicinal plants，etc.the basic anthocyanin biosynthesis pathways and molecular regula

3、tion mechanism were found out by researchers，but the system of whole anthocyanin synthesis network was not grasped fully at present .the study of anthocyanin biosynthesis and regulation should be strengthened continually.the biosynthesis and regulation of plant anthocyanin，including biosynthesis pat

4、hway，enzyme，structure genes，regulation genes，and transcript factors，was reviewed in order to provide theoretical support for the improvement and development of plant which was rich in anthocyanin.key words anthocyanin；biosynthesis；regulation植物的葉、花、果實、種子、莖干表皮等器官或組織呈現(xiàn)出來的色彩是由于植物體中存在不同的色素物質決定的，這些色素物質主要包

5、括類黃酮、類胡蘿卜素、甜菜素和葉綠素等，其中花青素是類黃酮色素中最豐富的的一類，屬于水溶性色素，大量地存在于植物的液泡中，決定大部分植物的顏色。植物體內的花青素常與各種單糖結合形成糖苷，也稱為花青素苷。植物中主要存在6種常見的花青素苷：天竺葵素（pelargonidin）、矢車菊素（cyanidin）、飛燕草素（delphinidin）、芍藥素（peonidin）、矮牽牛素（petunidin）和錦葵素（malvidin），其中芍藥素是由矢車菊素甲基化形成的，矮牽牛素和錦葵素是由飛燕草素再不同程度的甲基化形成的1（圖1）。1 花青素的生物合成途徑植物花青素是黃酮類化合物的一個亞類，其生物合成途

6、徑的研究較為成熟?；ㄇ嗨厥窃诩毎|中進行，從苯丙氨酸開始，經過一系列酶促反應合成，再經過不同的糖基、甲基、?；绒D移酶的修飾后被轉運儲存在液泡中2。花青素生物合成途徑可以分為3個階段（圖2）：第一階段為苯丙氨酸（phenylalanine）和乙酸（acetic acid）經過一系列轉化合成花青素的直接前體p-香豆酰輔酶a（p-coumaroyl-coa）和丙二酰輔酶a（malonyl-coa）；第二階段為類黃酮代謝，是從p-香豆酰輔酶a和丙二酰輔酶a開始，直到形成二氫黃酮醇；第三階段為花青素的生成，即二氫黃酮醇經過二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，d

7、fr）催化生成無色花色素，再經過花色素合成與轉化等酶的催化形成有色的花色素3。在第一階段中，苯丙氨酸經過苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，pal）脫氨形成肉桂酸（transcinnamic acid），肉桂酸被肉桂酸4-羥化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，c4h）羥化生成p-香豆酸（p-coumaric acid，4-香豆酸），p-香豆酸在4-香豆酸輔酶a連接酶（4-coumaric acid：coa ligase，4cl）催化下生成p-香豆酰輔酶a；乙酸在乙酰輔酶a連接酶（acetyl-coa ligase，acl）和乙酰輔酶

8、a羧化酶（acetyl-coa carboxylase，acc）的作用下生成丙二酰輔酶a2，4-5。在第二階段中，查耳酮合成酶（chalcone synthase，chs）為類黃酮合成途徑中的第1個關鍵酶，以4-香豆酰輔酶a與丙二酰輔酶a為底物催化生成查耳酮（chalcone）。查耳酮由查耳酮異構酶（chalcone isomerase，chi）催化形成柚皮素（naringenin），柚皮素由黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，f3h）催化生成各類花青素苷的必要前體物質二氫山萘酚（dihydrokaempferol，dhk）。類黃酮3-羥化酶（flavonoid

9、3-hydroxylase，f3h）和類黃酮3，5-羥化酶（f35h）在dhk的不同位點進行羥基化，分別形成二氫槲皮素（dihydroquercetin，dhq）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，dhm）2，4。在第三階段中，dhk、dhq和dhm經過二氫黃酮醇4-還原酶 （dihydroflavonol-4-reductase，dfr）還原形成無色的花色素苷元，即無色的天竺葵苷元、矢車菊苷元和飛燕草苷元。它們在花青素苷合成酶（anthocyanidin aynthase，ans）的催化下分別生成天竺葵素苷元、矢車菊苷元和飛燕草素苷元，最后經過尿苷二磷酸-葡萄糖：類黃酮-3-o-

10、葡糖基轉移酶（udp-glucose：flavonoid-3-o-glucosyltransferase（uf3gt或3gt）、類黃酮5-o-糖基轉移酶（flavonoid-5-o-glucosyltransferase，5gt）、鼠李唐基轉移酶（upd rhamnose：anthocyanidin-3-glucoside-rhamnosyltransferase，3rt）、?；D移酶（acyltransferase，at）和甲基轉移酶（methyltransferase，mt）等酶的轉化，生成更穩(wěn)定的花青素苷2，4，6。最后，花青素經過谷胱甘肽s-轉移酶（glutathione s-tran

11、sferase，gst）轉運到液泡儲存6。2 花青素的生物合成關鍵結構基因根據花青素生物合成的途徑，第一階段是與其他次生代謝共有的反應，第二、三階段是花青素代謝的前期和后期2個部分，對于花青素生物合成至關重要。在花青素生物合成過程中，至少需要15種結構基因的協(xié)同作用，所涉及的基因可以分為2類：一類是前期合成基因，如chs、chi、f3h、f3h和f35h的相關基因；另一類是后期合成基因，如dfr、ans、uf3gt、mt和rt等相關基因2。2.1 查耳酮合成酶（chs）基因chs催化合成查耳酮，為花青素的生物合成提供基本骨架，該酶是一類多基因家族編碼的酶7-8。目前，已經在葡萄9等植物中得到該

12、類基因，該基因具有一定的保守性。降低chs基因的表達水平，會導致植物花色變淡10。因此，調控植物體內chs基因的表達水平會對花青素的合成產生影響。2.2 查耳酮異構酶（chi）基因chi催化查耳酮的異構化反應，生成黃烷酮，將黃色的查耳酮轉變成無色的黃烷酮，它也是一種多基因家族編碼的酶。chi基因已經從多種植物中分離出來11-14，chi基因被分為type和type 2類。其中，type的chi只能催化6-羥基査耳酮生成5-羥基黃烷酮；type 的chi除了催化6-羥基査耳酮生成5-羥基黃烷酮外，還可以催化6-脫氧査耳酮生成5-脫氧黃烷酮15。2.3 黃烷酮3-羥化酶（f3h）基因f3h催化黃烷

13、酮c環(huán)上的羥基化反應生成二氫黃酮醇，是花青素生物合成途徑中前期階段的關鍵酶。f3h屬于氧化戊二酸依賴型加氧酶家族，是一種非血紅素鐵酶，依賴于fe2+、分子氧、抗壞血酸和2-酮戊二酸而起作用16-21。多數(shù)植物的f3h基因由2個外顯子組成，編碼350380個氨基酸22。2.4 類黃酮3-羥化酶（f3h）基因和類黃酮3，5-羥化酶（f35h）基因f3h和f35h可以催化黃烷酮或黃烷醇b環(huán)上的羥基化反應，分別生成二氫槲皮黃酮和二氫楊梅黃酮，這2種酶都屬于細胞色素p450超家族，它們在序列上具有較高的同源性23-25。利用f3h催化的底物dhk生成天竺葵素，最終形成粉色花26。而f35h的催化產物是藍

14、紫色的錦葵色素合成的關鍵前體，因此，f35h在藍紫色花朵或果等器官的形成中起重要作用27。2.5 二氫黃酮醇還原酶（dfr）基因dfr催化dhk、dhq、dhm生成的無色花青素，屬于花青素生物合成途徑后期反應的直接前體，dfr屬于還原性輔酶（nadph）依賴性的還原酶家族9，28-29。dfr的催化作用在不同植物中對底物具有一定的特異性，如大花蕙蘭的dfr不能有效地還原dhk而生成天竺葵素30，矮牽牛的dfr上存在一段26個氨基酸殘基，該序列決定了dfr對底物的特異性31。dfr基因特異性在花中表達，與花的著色過程密切相關32。2.6 花青素合成酶（ans）基因ans是一種2-酮戊二酸依賴性酶

15、，屬于戊二酸依賴型加氧酶家族33，是植物花青素生物合成途徑中的一個關鍵酶。ans基因的結構相對比較保守，一般含有2個外顯子和1個內含子9，33-34。ans基因的表達直接影響植物花青素的積累，降低ans的表達水平，會導致花青素合成水平明顯下降，產生白色花朵35。而過表達ans可以增加花青素的積累36。2.7 其他結構基因經過ans催化生成不穩(wěn)定的花青素，還需要迅速經歷一些修飾反應，主要包括糖基化、甲基化和?；磻?。這些反應主要包括葡萄糖基轉移酶（glucosyltransferase，gt）、鼠李糖基轉移酶（rhamnosyltransferase，rt）、 o-甲基轉移酶（0-methyl

16、transferase，omt）、?；D移酶（acyltransferase，at）等結構類基因，與其他花青素合成基因協(xié)同在植物發(fā)育期調控花青素的代謝。upd-葡萄糖：類黃酮-3-o-葡糖基轉移酶（3gt），是將udp-葡萄糖上的葡萄糖基轉移到花青素分子的c3羥基上37-41，形成花青色素3-葡糖苷，促進植物花或果實著色。在花青色素3-葡糖苷形成后，還需要經過鼠李唐基轉移酶（3rt）進一步修飾而生成花青色素3-蕓香苷42?；ㄇ嗨丶谆D移酶（mt）參與修飾花青素的結構，比如促使花青素c環(huán)第3位置上或第3、5位置的甲基化，可以增加植物色彩的多樣性43?；ㄇ嗨仵；D移酶（at）能夠把特異的有機酸轉移

17、到花青素骨架上，從而提高花青素的水溶性和穩(wěn)定性44-45。3 花青素生物合成的相關轉錄調控在花青素生物合成過程中，調控基因編碼的轉錄因子通過特異蛋白（包括dna蛋白、相互作用的蛋白-蛋白等）激活或者抑制結構基因的時空表達而影響花青素生物合成的強度和模式。目前研究表明，參與花青素調節(jié)的轉錄因子類型包括myb、myc、bhlh、bzip、wd40、wrky、mads-box等46。大多數(shù)植物是通過myb、bhlh、wd40調控花青素的生物合成，不同轉錄因子調控花青素合成的基因也不盡相同（表1）。3.1 花青素生物合成的相關轉錄因子3.1.1 myb轉錄因子。myb（myeloblastosis）轉

18、錄因子是植物中重要的一類轉錄因子，屬于dna結合蛋白，具有高度保守的dna結合域myb結合域，每個myb結合域一般含有3個高度保守的色氨酸殘基，這些保守的色氨酸殘基和間隔序列維持了myb蛋白結構域“螺旋-轉角-螺旋”的構型。參與調控花青素生物合成相關的myb轉錄因子包括r2r3-myb和r3-myb2類47?；ㄇ嗨厣锖铣芍械膍yb蛋白相關基因最早在玉米中發(fā)現(xiàn)，并克隆出第1個調節(jié)花青素合成的編碼myb蛋白的c1基因，該基因調控著糊粉層花青素的生物合成；另外一個編碼myb蛋白的基因pl在玉米其他組織中調節(jié)花青素合成。c1與pl高度同源，因此pl被看作是c1的拷貝基因72。在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)了編碼my

19、b蛋白的基因包括：an2、ph4和an4。an2只在花瓣邊翼表達54，ph4在花瓣表皮中表達，an4編碼花粉囊中的myb蛋白73。擬南芥中與花青素合成相關的編碼r2r3-myb蛋白基因包括pap1和pap2，編碼r3-myb蛋白基因為mybl2。pap1和pap2與玉米的c1序列的相似性， pap1和pap2可能與c1為相同家族成員74。mybl2被認為是花青素合成途徑上的一個抑制子，其抑制機制可能是由于它和這一途徑上的bhlh轉錄因子競爭而與ttg1、pap1/pap2形成絡合物，這個絡合物與dfr啟動子結合而抑制dfr基因的轉錄，所以造成花青素合成受阻75。蘋果中轉錄因子屬于r2r3-my

20、b型，編碼轉錄蛋白的基因有mdmmyb1和mdmmyba。mdmmyb1在擬南芥和葡萄培養(yǎng)細胞中異源表達可以誘導花青素的超表達76，mdmmyba從蘋果果皮中分離得到，其表達具有組織和品種特異性，mdmmyba蛋白特異結合于花青素合酶的啟動子69。3.1.2 bhlh轉錄因子。bhlh（basic helix-loop-helix，堿性螺旋-環(huán)-螺旋）轉錄因子是植物中第二大轉錄因子超家族，僅次于myb轉錄因子。在bhlh轉錄因子的蛋白結構中，含有保守的bhlh基序，每個bhlh基序約由60個氨基酸殘基組成，含有2個亞功能區(qū)，即位于n末端的堿性氨基酸dna結合區(qū)和c末端的hlh區(qū)。植物bhlh轉

21、錄因子參與調控多種生理途徑，其中調控花青素合成是其重要功能之一。玉米基因組中編碼bhlh的基因主要包括r1、b1、lc和in1等，r1蛋白可能通過形成二聚體（bhlh結構域和act結構域）發(fā)揮調控花青素合成的功能。b1基因調節(jié)多個組織中花青素的合成，但很少影響糊粉層和幼苗的顏色；lc基因調節(jié)葉中脈、葉舌、葉緣和果皮等組織的著色49。in1基因能夠編碼與r1高度同源的bhlh轉錄因子， in1基因轉錄產物可與r1/b1結合，阻止二聚體形成以及r1/b1與dna結合，還能與c1/pl1的r2r3-myb結構域結合，阻止它們發(fā)揮功能，從而抑制花青素合成77。擬南芥中參與調控花青素合成的bhlh蛋白都

22、聚集于bhlh家族第三亞組（subgroup iii），有tt8、gl3、egl3和myc1 78-79。主要通過參與形成mbw（myb-bhlh-wd40）復合物調節(jié)花青素合成57。矮牽牛中調節(jié)花青素合成的bhlh蛋白有2個：an1和jaf13。an1基因與結構基因dfr同源，可直接調節(jié)dfr的表達。花藥中an1的表達依賴于an4 （r2r3-myb），在an4功能缺失的葉片和花藥中an2 （r2r3-myb）能夠重新激活an1的表達，表明an2和an4均是an1表達的激活因子53，80。jaf13基因與an2一起在葉片中瞬時表達能夠激活dfr啟動子，卻不影響chs和f3h等早期基因的表達8

23、1。龍膽是一種觀花植物，花色碧藍鮮艷，它的bhlh轉錄因子gtbhlh1與矮牽牛an1蛋白高度同源，gtbhlh1基因表達模式與花青素合成結構基因表達模式一致71。金魚草的編碼bhlh基因delila63-64，具有較強的組織特異性，主要在花冠、萼片、子葉和莖中起作用16。3.1.3 wd40轉錄因子。wd40蛋白是一類大的蛋白家族，這類蛋白結構高度保守，一般含有416個串聯(lián)重復的wd基元。wd基元存在于真核生物的1%2%蛋白質中82，是一個高度保守的核心區(qū)域，每個wd基元含有大約由40個氨基酸殘基組成的保守序列，該序列以n末端1124個殘基處gh二肽（gly-his，gh）開始， c末端以w

24、d 結尾（trp-asp，wd）83。在矮牽牛中，wd40轉錄因子an11會對結構基因dfr的表達量產生影響，從而調控花的色素積累84。在模式植物擬南芥中，ttg1蛋白是wd40轉錄因子，與矮牽牛an11具有高度的同源性85，ttg1影響dfr的功能，誘導dfr的表達86。在玉米中，pac1編碼wd40蛋白，在pac1缺失突變體中，pac1的缺失導致a1、bz1 和c2 等花色素苷結構基因的表達下調，在種子的糊粉層沒有花青素的積累48，87-88。在紫蘇葉子中也發(fā)現(xiàn)花青素合成相關的wd40型pfwd蛋白，它含4個wd重復序列，氨基酸序列與an11和ttg1較為相似，也相當保守，推測pfwd可能

25、通過與myc家族蛋白共同作用，可從細胞質中轉移到細胞核上，在花青素合成等信號轉導途徑中起著信號傳遞的作用66。3.2 轉錄因子與結構基因的作用形式3.2.1 轉錄因子單獨或協(xié)同調控結構基因。轉錄因子單獨調節(jié)花青素的生物合成，例如番茄中的轉錄因子ant1調節(jié)果實中花青素的積累，金龜草ammyb305的調控不依賴于bhlh類轉錄因子就可激活合成途徑結構基因的表達67，89。轉錄因子可以通過協(xié)作方式調控花青素的生物合成，例如擬南芥鋅指蛋白tt1與同源域蛋白anl2共同調控花青素的積累90。擬南芥tt2基因編碼的myb蛋白依賴bhlh型轉錄因子tt8的作用，共同控制dfr基因的表達55。3.2.2 轉

26、錄因子在不同位點上調控結構基因。在不同種類的植物中，轉錄因子調節(jié)花青素生物合成的作用位點不同。如轉錄因子在金魚草中調控f3h與下游dfr、ans、3gt等基因的表達，卻在矮牽牛中是調控下游dfr、ans、3gt、gst等基因的表達，而在玉米中又是調控chs與下游dfr、3gt等基因的表達2。在過表達pap1或pap2基因的擬南芥植株中，pal、chs和dfr的表達水平均有所提高，但dfr基因的表達提高程度強于pal和chs基因的提高程度。轉錄因子egl3和gl3主要調控花青素合成途徑晚期基因dfr、ldox和uf3gt的表達91。ttg1調控dfr、ldox基因的表達，但不影響chs、chi和

27、f3h基因的表達34，91。一些不依賴于wd40蛋白的myb類轉錄因子則調控花青素合成途徑早期基因pal、chs、chi、f3h和f3h的表達58。4 展望盡管前人已經通過研究明確了花青素生物合成途徑，但是花青素的合成代謝過程非常復雜，還沒有完全掌握。近年來，通過突變體和轉基因等技術，對花青素代謝及分子調控進行更加深入的探索，陸續(xù)分離、鑒定和克隆了花青素相關結構基因和調控基因，然而還并沒有完全掌握花青素合成的整個網絡體系。因此，還需要借助現(xiàn)代轉基因技術、測序技術、rna干擾技術、生物信息分析技術和組學（基因組學、轉錄組學、蛋白組學等）技術等，進一步對花青素生物合成與調控機制進行研究，著力解決植

28、物花青素合成中調控機制和體系、花青素代謝與其他代謝的關系與影響機制、生物環(huán)境和非生物環(huán)境對花青素合成的影響、花青素的修飾與轉運等問題，為花青素類植物品種改良和開發(fā)提供理論支持。參考文獻1grotewold e.the genetics and biochemistry of floral pigmentsj.annual review of plant biology，2006，57：761-780.2 holton t a，cornish e c.genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesisj.plant cell，1995，7（

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49、 anthocyanidin synthase gene in torenia hybrida yields white flowers with higher frequency and better stability than antisense and sense suppressionj.plant biotechnology，2006，23：13-17.36 reddy a m，reddy v s，scheffler b e，et al.novel transgenic rice overexpressing anthocyanidin synthase accumulates a

50、 mixture of flavonoids leading to an increased antioxidant potentialj.metabolic engineering，2007，9（1）：95-111.37 dooner h k，weck e，adams s，et al.a molecular genetic analysis of insertions in the bronze locus in maizej.mol gen genet，1985，200：240-246.38 martin c，prescott a，mackay s，et al.control of ant

51、hocyanin biosynthesis in flowers of antirrhinumj.the plan journal，1991，1（1）：37-49.39 ford c m，boss p k，hoj p b.cloning and characterization of vitis vinifera udpglucose：flavonoid 3oglucosyltransferase，a homologue of the enzyme encoded by the maize bronze1 locus that may primarily serve to glucosylat

52、e anthocyanidins in vivoj.journal of biological chemistry，1998，273（15）：9224-9233.40 hu c y，gong y f，jin s，et al.molecular analysis of a udpglucose：flavonoid 3oglucosyltransferase （ufgt） gene from purple potato （solanum tuberosum）j.molecular biology reports，2011，38（1）：561-567.41 wen x c，han j，leng x

53、p，et al.cloning and expression of udpglucose：flavonoid 3oglucosyltransferase gene in peach flowersj.genetics and molecular research，2014，13（4）：10067-10075.42 brugliera f，holton t a，stevenson t w，et al.isolation and characterization of a cdna clone corresponding to the rt locus of petunia hybridaj.pl

54、ant journal，1994，5（1）：81-92.43 jonsson l m v，de vlaming p，wiering h，et al.genetic control of anthocyaninomethyltransferase activity in flowers of petunia hybridaj.theor appl genet，1983，66（3/4）：349-355.44 fujiwara h，tanaka y，yonekurasakakibara k，et al.cdna cloning，gene expression and subcellular loca

55、lization of anthocyanin 5aromatic acyltransferase from gentiana trifloraj.plant journal，1998，16（4）：421-431.45 nakatsuka t，nishihara m，mishiba k，et al.temporal expression of flavonoid biosynthesisrelated genes regulates flower pigmentation in gentian plantsj.plant science，2005，168（5）：1309-1318.46 寧張，

56、胡宗利，陳緒清，等.植物花青素代謝途徑分析及調控模型建立j.中國生物工程雜志，2008，28（1）：97-105.47 linwang k，bolitho k，grafton k，et al.an r2r3 myb transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in rosaceaej.plant biology，2010，10：50.48 carey c c，strahle j t，selinger d a，et al.mutations in the pale

57、aleurone color1 regulatory gene of the zea mays anthocyanin pathway have distinct phenotypes relative to the functionally similar transparent testa glabra1 gene in arabidopsis thalianaj.plant cell，2004，16（2）：450-464.49 ludwig s r，habera l f，dellaporta s l，et al.lc，a member of the maize r gene family

58、 responsible for tissuespecific anthocyanin production，encodes a protein similar to transcriptional activatorsj.proc natl acad sci usa，1989，86（18）：7092-7096.50 hernandez j m，heine g f，irani n g，et al.different mechanisms participate in the rdependent activity of the r2r3 myb transcription factor c1j.journal of biological chemistry，2004，279（46）：48205-48213.51 singer t，