單分子檢測技術(shù)（課堂PPT）

1、單分子檢測單分子檢測Single Molecules Detection 高等分析化學(xué)與實驗高等分析化學(xué)與實驗2Outline of my presentationvIntroductionHistory and background Single Molecules Detection(SMD)vSMD in modern chemistry Electrochemical Detection Fluorescence Spectroscopy Localized Surface Plasmon Resonance(LSPR) A33Push your research into extre

2、mes! Extremely small space (sub micrometer to nanometer) Extremely low concentration (pico molar, femto molar 10-15, atto molar) Dynamic environment (binding, conformation changing, diffusion)Single Molecules D4定義定義v1.1. 單分子檢測技術(shù)是檢測靈敏度達到分子水平的單分子檢測技術(shù)是檢測靈敏度達到分子水平的一系列高靈敏檢測技術(shù)。一系列高靈敏檢測技術(shù)。v2.2.單分子檢測是分析化學(xué)家長

3、期以來夢寐以求的單分子檢測是分析化學(xué)家長期以來夢寐以求的一一項富有挑戰(zhàn)性的前沿領(lǐng)域項富有挑戰(zhàn)性的前沿領(lǐng)域,達到了分子檢測靈敏達到了分子檢測靈敏度的極限度的極限,是物質(zhì)低含量監(jiān)測技術(shù)中最后一個里程是物質(zhì)低含量監(jiān)測技術(shù)中最后一個里程碑。碑。v特點：檢測空間尺度在納米數(shù)量級特點：檢測空間尺度在納米數(shù)量級, ,檢測的分子數(shù)檢測的分子數(shù)目或相關(guān)事件一般在幾個目或相關(guān)事件一般在幾個( (次次) )到幾千個到幾千個( (次次) )的范的范圍。圍。5背景背景 我們?yōu)槭裁葱枰獑畏肿訖z測？我們?yōu)槭裁葱枰獑畏肿訖z測？ 對超靈敏度檢測技術(shù)的需求！對超靈敏度檢測技術(shù)的需求！ 例：例：AIDS的研究的研究 未檢出未檢出不

4、存在不存在6 2 3光學(xué)方法光學(xué)方法, ,包包括表面增強拉括表面增強拉曼光譜、共聚曼光譜、共聚焦熒光顯微法焦熒光顯微法等等掃描探針顯微掃描探針顯微方法方法, ,包括掃包括掃描隧道顯微鏡描隧道顯微鏡等等 研究方法研究方法 1化學(xué)方法化學(xué)方法, ,包包括電化學(xué)檢括電化學(xué)檢測，化學(xué)發(fā)測，化學(xué)發(fā)光檢測等光檢測等7 共同特征共同特征123單分子檢測的研究方法單分子檢測的研究方法高空間分辨能高空間分辨能力；力；單分子性質(zhì)單分子性質(zhì)和行為的捕和行為的捕獲能力；獲能力；能收集微弱信能收集微弱信號并放大檢測號并放大檢測, ,并做相應(yīng)的分并做相應(yīng)的分析處理以獲取析處理以獲取可信的信息?？尚诺男畔ⅰ?單分子電化學(xué)檢

5、測單分子電化學(xué)檢測v 溶液中分子在兩個電極間進行反復(fù)循環(huán)氧化還溶液中分子在兩個電極間進行反復(fù)循環(huán)氧化還原反應(yīng)原反應(yīng),形成回路和可測量的電流形成回路和可測量的電流,據(jù)此可進行據(jù)此可進行SMD.v 通過使用特制的納米微電極，將少量待測電通過使用特制的納米微電極，將少量待測電活性分子捕獲在納米微電極與基底之間；在擴散活性分子捕獲在納米微電極與基底之間；在擴散作用下，分子穿梭于微電極與基底之間，從而形作用下，分子穿梭于微電極與基底之間，從而形成電流，通過檢測形成的電流從而實現(xiàn)單分子的成電流，通過檢測形成的電流從而實現(xiàn)單分子的檢測。檢測。v可以確定半反應(yīng)電勢自由能及反應(yīng)動力學(xué)可以確定半反應(yīng)電勢自由能及反

6、應(yīng)動力學(xué)9單分子電化學(xué)檢測單分子電化學(xué)檢測v單分子的電化學(xué)檢測的兩個前提條件單分子的電化學(xué)檢測的兩個前提條件: v (1)要能獨立檢測發(fā)生在納米尺度空間的反應(yīng)要能獨立檢測發(fā)生在納米尺度空間的反應(yīng)變化變化,實現(xiàn)對有限個數(shù)分子的捕獲。（使用納米微實現(xiàn)對有限個數(shù)分子的捕獲。（使用納米微電極）電極）v (2)需要把反映單分子行為的微弱信號放大到需要把反映單分子行為的微弱信號放大到可以檢測的程度。可以檢測的程度。10單分子電化學(xué)檢測單分子電化學(xué)檢測檢測分子：三甲銨甲基二茂鐵檢測分子：三甲銨甲基二茂鐵 (Cp2FeTMA+)電解質(zhì)：電解質(zhì)：NaNO3電極：電極：Pt-Ir微電極，包裹在納米級厚微電極，包裹

7、在納米級厚 度的蠟鞘中。度的蠟鞘中?；祝簩?dǎo)電基底基底：導(dǎo)電基底檢測方法：掃描電化學(xué)顯微鏡，并采用檢測方法：掃描電化學(xué)顯微鏡，并采用 正反饋工作模式實現(xiàn)信號放大正反饋工作模式實現(xiàn)信號放大, 檢測到檢測到pA級電流。級電流。結(jié)果：探針電流呈現(xiàn)離散變化。結(jié)果：探針電流呈現(xiàn)離散變化。 電流值為電流值為0. 5 pA、1. 0 pA和和0 pA的概率大的概率大,這這3個電流值分別對應(yīng)著在個電流值分別對應(yīng)著在探測空間中存在探測空間中存在1個、個、2個或個或0個電活性個電活性分子。分子。11單分子電化學(xué)檢測單分子電化學(xué)檢測 檢測分子本身檢測分子本身的電荷變化，是的電荷變化，是一種直接檢測；一種直接檢測；幾

8、乎不影響被測幾乎不影響被測對象；適合和其對象；適合和其他方法聯(lián)用他方法聯(lián)用優(yōu)點缺點 電極制備復(fù)電極制備復(fù)雜，合格率較雜，合格率較低；電極不一低；電極不一樣，實驗結(jié)果樣，實驗結(jié)果重現(xiàn)性不好。重現(xiàn)性不好。12單分子熒光檢測單分子熒光檢測v基本原理基本原理:在激光照射下在激光照射下,熒光分子從基態(tài)到激發(fā)熒光分子從基態(tài)到激發(fā)態(tài)態(tài),發(fā)射光子回到基態(tài)。根據(jù)熒光壽命和分子在激發(fā)射光子回到基態(tài)。根據(jù)熒光壽命和分子在激光束中停留時間光束中停留時間,可算出單個分子發(fā)射的最大光子可算出單個分子發(fā)射的最大光子數(shù)為數(shù)為105106。目前光學(xué)檢測系統(tǒng)收集、檢測。目前光學(xué)檢測系統(tǒng)收集、檢測光子的效率約為光子的效率約為1%或

9、或0.5%5%,故單個分子故單個分子仍可被檢測到數(shù)千光子信號。仍可被檢測到數(shù)千光子信號。v檢出限約為檢出限約為10-13mol/L，應(yīng)用最廣！，應(yīng)用最廣！13單分子熒光檢測單分子熒光檢測單分子的識別單分子的識別 1.光譜法；光譜法； 2.熒光壽命法，納秒級；熒光壽命法，納秒級； 3.光子爆發(fā)量光子爆發(fā)量(強度強度)，分子不同，分子不同,熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率等光物理性質(zhì)不同等光物理性質(zhì)不同,導(dǎo)致發(fā)射的光子數(shù)不同；導(dǎo)致發(fā)射的光子數(shù)不同； 4.時間分辨熒光各向異性。時間分辨熒光各向異性。14單分子熒光檢測單分子熒光檢測 操作基本無太操作基本無太大難度，易于實大難度，易于實現(xiàn)；檢測效率比現(xiàn)；檢測效

10、率比較高；可進行實較高；可進行實時監(jiān)測時監(jiān)測優(yōu)點缺點 測定生物大測定生物大分子如蛋白質(zhì)分子如蛋白質(zhì)和核酸需要進和核酸需要進行外部標(biāo)記行外部標(biāo)記15局域表面等離子體共振檢測局域表面等離子體局域表面等離子體是存在于金屬納米粒子或不連續(xù)是存在于金屬納米粒子或不連續(xù)的金屬納米結(jié)構(gòu)中的電荷密度震蕩。的金屬納米結(jié)構(gòu)中的電荷密度震蕩。局域表面等離子共振局域表面等離子共振是當(dāng)金屬納米粒子被入射光激是當(dāng)金屬納米粒子被入射光激發(fā)時發(fā)時,因內(nèi)部自由電子的協(xié)同振蕩而產(chǎn)生的共振。因內(nèi)部自由電子的協(xié)同振蕩而產(chǎn)生的共振。1616光與金屬納米顆粒的相互作用過程：激發(fā)光攜帶一定強度的電場自由電子在電場中開始振蕩激發(fā)電場和電子的

11、振蕩形成共振自由電子吸收能量被共振激發(fā)自由電子返回基態(tài)并釋放能量能量形式：熱能 + 發(fā)射光子(散射光)局域表面等離子體共振17LSPR傳感器v理論上所有的金屬、合金、半導(dǎo)體材料都可以做理論上所有的金屬、合金、半導(dǎo)體材料都可以做成成LSPR傳感器，常用金、傳感器，常用金、 銀、鉑等貴金屬。銀、鉑等貴金屬。LSPR的吸收光譜峰值處的吸收波長取決于材料的吸收光譜峰值處的吸收波長取決于材料的微觀結(jié)構(gòu)特性，如組成、的微觀結(jié)構(gòu)特性，如組成、 形狀、形狀、 大小、大小、 局域局域傳導(dǎo)率。傳導(dǎo)率。18LSPR傳感器19單分子電化學(xué)檢測單分子電化學(xué)檢測 無需標(biāo)記；無無需標(biāo)記；無污染、實時、高污染、實時、高靈敏度靈敏度優(yōu)點缺點 納米顆粒制納米顆粒制備復(fù)雜；信噪備復(fù)雜；信噪比低；對檢測比低；對檢測器要